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國立臺灣大學 藥理學研究所 黃慧貞所指導 陳惠文的 植物成份curcumin及alisolBacetate對細胞生長與凋亡之作用暨可能之抗動脈硬化機轉 (1998),提出薑黃素ptt關鍵因素是什麼,來自於薑黃素、細胞週期、細胞凋亡、動脈粥狀硬化、血管平滑肌細胞。
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植物成份curcumin及alisolBacetate對細胞生長與凋亡之作用暨可能之抗動脈硬化機轉
為了解決薑黃素ptt 的問題,作者陳惠文 這樣論述:
本篇論文主要在體外以大鼠血管平滑肌細胞(A7r5 cells)和人類淋巴癌細胞(CEM lymphocytes),研究薑黃的主成分─curcumin (diferuloylmethane),和澤瀉主成份─alisol B acetate,具有抗細胞增生(antiproliferation)與導引細胞凋亡(apoptosis)作用,並探討其分子作用機轉。並進一步以高脂血兔子為動脈粥狀硬化的動物模式,來研究curcumin在活體動物對動脈粥狀硬化病變的藥理作用。此外,我們以離體的兔子血管環來測定curcumin清除自由基的能力;並且在大鼠心肌細胞(H9c2 cells)觀察curcumin和fu
llerenols對過氧化氫(H2O2)導引細胞凋亡的保護作用。 我們以細胞的[3H]-thymidine攝入量來測定細胞中DNA生成量,並以此表示細胞的增生。薑黃素(curcumin)及其它相關之化學物質 (esculetin,baicalein,ferulic acid,和epigallocatechin)在10-6至10-4 M濃度範圍對於胎牛血清引起的血管平滑肌細胞(包括:大鼠血管平滑肌細胞株A7r5 cell line和培養的兔子血管平滑肌細胞)增生皆具有濃度相依性(concentration-dependent)的抑制作用。其中以curcumin抑制作用最大,而
ferulic acid的作用最小。我們利用trypan blue dye exclusion method來測定細胞存活率(cell viability),10-6至10-5 M濃度之curcumin對於A7r5細胞的存活率沒有影響。而10-4 M curcumin使細胞存活率有意義的降低到少於基準值(2105 cells)。 為了更進一步探討藥物對細胞週期的影響,我們先以細胞的[3H]-thymidine攝入量來分析細胞週期中的不同時期的進行過程,以每三小時測一次細胞的[3H]-thymidine攝入量來觀察細胞週期(cell cycle)的進行。A7r5 cells
在靜止生長48小時後,以10 %胎牛血清刺激後9到12小時DNA生成開始明顯增加,此階段稱為 G1/S phase,是細胞由靜止階段進入細胞分裂的一個重要分界點﹔在15到18小時達到一個高原期,此階段稱為 S phase,而兔子的血管平滑肌細胞在12到15小時達到G1/S phase﹔在21到24小時達到S phase。Curcumin及其它相關化學物質(esculetin,baicalein,ferulic acid,和epigallocatechin)在10-6至10-4 M濃度範圍皆能濃度相依性的在G1/S phase和S phase抑制細胞之[3H]-thymidine攝入量。我們更進
一步利用流式細胞儀(flow cytometry),以propidium iodide (PI)來染細胞核內的DNA,以確認curcumin及其它相關化學物質(esculetin,baicalein,ferulic acid,和epigallocatechin)對細胞週期中G0/G1,S,G2/M phases分布情形之影響。結果顯示curcumin確實能使靜止生長的血管平滑肌細胞繼續停留在G0/G1 phase,並減少細胞在S phase的百分比。流式細胞儀的分析發現,curcumin 在10-4 M的濃度下會導引細胞凋亡。我們的結果顯示,curcumin會使細胞停止生長並導引細胞凋亡而減少
細胞對[3H]-thymidine攝入量。再以蘇木紫-依紅(hematoxylin-eosin)染色法、細胞凋亡分析法(TdT-mediated dUTP nick end labeling assay;TUNEL) 、及DNA電泳來分析斷裂DNA片段所形成之DNA階梯(DNA laddering) …等方法,進一步證實了10-4 M curcumin會造成細胞萎縮、染色質濃染、DNA斷裂…等細胞進行凋亡時典型的現象。證明curcumin會導引血管平滑肌細胞凋亡(apoptosis; programmed cell death)。 研究curcumin抑制細胞增生及導引細胞
凋亡的可能作用機轉,curcumin在10-6至10-4 M濃度範圍能濃度相依性的抑制細胞膜上蛋白質酪氨酸激酉每 (protein tyrosine kinase)的活性,在西方墨點分析法中亦證明curcumin在10-6至10-4 M濃度範圍可濃度相依性的抑制蛋白質酪氨酸激酉每 受質(大約180 kDa)的磷酸化。另外,只有在10-4 M curcumin才會明顯的抑制蛋白質激酉每 C (protein kinase C)的活性,在西方墨點分析法中,curcumin在10-6至10-4 M濃度範圍可以濃度相依性的抑制protein kinas C的異構酉每 (PKC-)的translo
cation,而對於PKC-及PKC-的translocation則只有在10-4 M curcumin才會有明顯的抑制作用。利用反轉錄-聚合酉每 連鎖反應(RT-PCR)我們發現curcumin會影響一些與細胞凋亡相關的基因表現,其中,curcumin可抑制c-myc和bcl-2mRNA表現,而對p53mRNA表現則無明顯之影響。我們也用北方墨點法來確定此作用。我們的結果指出,curcumin可能經由抑制一些protein tyrosine kinase之訊息傳遞途徑,或 c-myc基因表現來停止細胞週期的進行,以抑制細胞增生;而經由抑制與protein tyrosine kinase,
protein kinase C之訊息傳遞途徑,或c-myc,及bcl-2之基因表現,來導引細胞凋亡。 我們也利用hyperlipidemic cholesterol-fed rabbit及hyperlipidemic cholesterol-fed alloxan-diabetic rabbit兩種高脂血動物模式,來研究curcumin在活體動物之作用,包括:血中總膽固醇(total cholesterol)、總三酸甘油酯(total triglyceride)、血液凝固、及血管心臟組織中platelet-derived growth factor-A (PDGF-A)
和transforming growth factor-1 (TGF-1)基因表現的變化,進而評估curcumin對活體動脈粥狀硬化病變之影響。我們將動物分為五組:第一組, 正常組(normal):餵食正常兔用標準飼料。第二組, 餵食高膽固醇飼料組(CHOL):餵食含1 % cholesterol及20 % corn oil的飼料。第三組, 餵食高膽固醇糖尿病組(CHOL+DM):餵食含1 % cholesterol及20 % corn oil的飼料之外,加上alloxan (60 mg/kg i.v.)引起糖尿病。第四組, Curcumin治療之餵食高膽固醇飼料組(curcumin tr
eated;CHOL+curcumin):CHOL的兔子連續施打curcumin (5 mg/kg/day, i.m.)五星期。第五組, Curcumin治療之餵食高膽固醇糖尿病組(curcumin treated;CHOL+DM+curcumin):CHOL+DM的兔子連續施打curcumin (5 mg/kg/day, i.m.)五星期。初步實驗結果顯示,血中總膽固醇及總三酸甘油酯,CHOL組及CHOL+DM組均可使血中總膽固醇及總三酸甘油酯濃度上升,CHOL+DM組在第三週之後更為明顯,甚至total cholesterol可達到1,377.7±354 mg/dl,而total trig
lyceride也會高到1,633±246 mg/dl。而在CHOL+curcumin組中,curcumin對total triglyceride有明顯的降低作用,但對total cholesterol則影響並不明顯。而在CHOL+DM+curcumin組可見到明顯的降低total cholesterol及total triglyceride。在血液凝固測定方面,凝血酵素原時間(prothrombin time;PT)及部分血栓時間(partial thromboplastin time;PTT)均無顯著影響。利用光學顯微鏡觀察不同位置的血管心臟形態變化,發現正常組的兔子在血管方面不論主動脈弓
、胸主動脈或腹主動脈,血管管腔皆平滑,內皮細胞排列規則。心臟方面,左心室沒有冠狀動脈硬化及心肌細胞肥厚現象。CHOL+DM 組的兔子血管方面其主動脈弓、胸主動脈明顯的有動脈硬化斑(atherosclerosis plaques),血管內膜有許多泡沫細胞堆積,且可見平滑肌細胞增生的現象,腹主動脈則病變部位較少。心臟方面並沒有明顯的病變發生。Curcumin處理過的兔子(CHOL+DM+curcumin組)會減少在主動脈弓、胸主動脈及腹主動脈所發生的動脈硬化斑、泡沫細胞及平滑肌細胞的增生,而心臟方面並沒有明顯影響。以反轉錄-聚合酉每 連鎖反應(RT-PCR)方法分析PDGF-A和TGF- mR
NA表現,CHOL+DM組在主動脈弓及胸主動脈增加PDGF-A mRNA的表現,在腹主動脈則增加TGF-β1 mRNA表現,左心室則有增加的傾向,但不具統計意義。而CHOL+DM+curcumin組可明顯的降低主動脈弓、胸主動脈PDGF-A mRNA的表現,及降低腹主動脈、左心室TGF-β1 mRNA的表現。 此外,在分離兔子胸部主動脈的體外實驗中,我們也發現curcumin能濃度相依性的抑制alloxan所引起superoxide anion的產生,這個結果顯示,curcumin在血管具有清除自由基(free radical scavenger)的性質。
綜合以上結果顯示,curcumin對高脂血兔子的作用,不但能降低高脂血兔子血中總膽固醇、總三酸甘油酯濃度。更能改善高脂血兔子主動脈弓、胸主動脈之動脈硬化形態上之病變。並降低CHOL+DM之兔子主動脈弓、胸主動脈PDGF-A之基因表現,以及降低腹主動脈、左心室TGF-β1之基因表現。此外,curcumin在血管中具有free radical scavenger的活性。Curcumin這些保護動脈硬化病變作用可能經由其降低血脂、free-radical scavenger之特性、及抑制血管平滑肌細胞增生而來。因此,薑黃素(curcumin) 可作為發展新一類藥物之模式(template),可能
應用於預防與研究動脈粥狀硬化(atherosclerosis),及血管成形術再阻塞(post-angioplasty restenosis)的血管病變。 減少心肌梗塞造成的缺血區域(myocardial ischemic area)的最有效的方法是再灌流(reperfusion) ,但是再灌流會使得自由基增加(包括, superoxide和hydroxyl radicals),而造成組織的傷害(包括, necrosis和apoptosis)。在兔子的心臟缺血/再灌流動物模式中,我們發現由缺血/再灌流區域的心肌細胞所抽取的DNA,會在水平電泳膠上呈現出大約180 bp的DNA
階梯片段,這結果顯示此區域心肌細胞受到缺血/再灌流的傷害,發生細胞凋亡。在實驗室中用過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)當做產生自由基的來源,我們發現過氧化氫在培養的大鼠心肌細胞(rat cardiac myoblast cell line, H9c2 cells)會導引細胞凋亡,而這作用會因為加入抗氧化劑,curcumin和芙醇fullerenols而減輕。Curcumin (10-5 M)可能除了以其free radicals scavenger的特性直接減少過氧化氫對心肌細胞的傷害外,也可能經由抑制細胞凋亡相關之訊息傳遞或基因之表現,而減少細胞凋亡的產生。
最近,我們發現中藥材澤瀉(Alisma rhizoma)的主成分之一alisol B acetate (alisol B-23-monoacetate) ,具有抑制細胞增生,和導引細胞凋亡的作用。因此,我們使用大鼠的血管平滑肌細胞(A7r5 cells)和人類淋巴癌細胞(CEM cells)來研究alisol B對於細胞增生或凋亡現象的作用。Alisol B在10-7至10-4 M濃度範圍會隨時間增加(24-48小時)而濃度相依性的抑制細胞受血清刺激所增加之[3H]-thymidine攝入量。經過48小時藥物處理之後,alisol B在A7r5細胞的IC50是(4.0±0.8)×1
0-6 M;而在CEM細胞的IC50是(2.5±1.2)×10-6 M。由細胞存活率的分析和細胞外型的觀察可見alisol B在10-4 M的濃度下會造成細胞死亡。利用流式細胞儀(flow cytometry)、抽取細胞DNA跑電泳、及TUNEL的分析,我們發現在加入10-4 M alisol B,4小時後便可觀察到細胞凋亡(apoptosis)現象的發生,並隨著時間的增加而更趨明顯,經過48小時後,從顯微鏡可觀察到細胞萎縮(cell shrinkage)、染色質濃染(chromatin condensation)、DNA斷裂(DNA fragmentation) 、和凋亡小體(apoptot
ic bodies)的產生、並且在DNA電泳上形成DNA階梯(DNA ladder)。但是在10-5 M 濃度(48 h)時作用則不太明顯,而小於10-5 M濃度的alisol B即使經過48小時仍不會引起細胞凋亡。由於alisol B與glucocorticoid的化學結構相似,因此我們比較alisol B 與dexamethasone (合成的glucocorticoid)導引細胞凋亡的作用和其機轉。由流式細胞儀的分析結果發現,細胞經過48小時dexamethasone (3×10-7 M)的處理會導引17.3±5.1 %的A7r5細胞凋亡,25.3±2.2 % 的CEM細胞凋亡。研究al
isol B誘導細胞凋亡的分子機轉,我們使用RT-PCR法來測定alisol B或dexamethasone對mRNA基因表現的影響。結果顯示,alisol B (10-5 M, 24 h)會造成c-myc的表現增加,dexamethasone則否;而對p53的表現則也只有alisol B增加其mRNA表現。由實驗結果得知,alisol B對於細胞增生的的抑制作用主要來自導引細胞凋亡的產生,而alisol B對於c-myc和p53基因表現的調節,可能在導引細胞凋亡過程中扮演部分的角色。但與alisol B結構相似的glucocorticoids類化合物的作用機轉,則其所影響的訊息傳遞路徑不同。
根據實驗結果,alisol B可用於發展藥物之模板(template),來預防或治療因血管平滑肌細胞過度增生所引起知心血管疾病(atherosclerosis、restenosis…等)、也可能用於抑制癌症、抑制免疫發炎細胞、或用於研究細胞凋亡。
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