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利用擇面光照明顯微術觀測生物組織透明化樣本

為了解決鏡子刮痕處理的問題，作者林廷翰 這樣論述：

致謝 i目錄 iii中文摘要 vii英文摘要 ix第1章 緒論 11-1 實驗背景 11-2 研究動機及目的 31-3 論文架構 4第2章 實驗原理簡介 52-1 擇面光照明顯微術 52-2 生物組織澄清技術(Tissue clearing) 10第3章 研究方法與架設 133-1 實驗架設 133-2 視野範圍與雷射光薄片照明規格推算 173-3 擇面光照明顯微術影像校正步驟 193-4 點擴散函數(Point spread function, PSF)計算及影像反捲積(Deconvolution) 2

43-5 影像量化 263-6 樣本準備 283-6.1 螢光小球樣本 283-6.2 果蠅胚胎樣本(Drosophila embryo) 293-6.3 組織透明化樣本 303-7 實驗流程 34第4章 實驗結果與討論 354-1 果蠅胚胎活體掃描結果 354-2 H&E染色組織切片掃描結果 364-3 組織透明化小鼠舌頭切片掃描結果與共軛焦螢光顯微鏡比較 384-4 將多組影像對位組合 424-5 影像量化結果 49第5章 結論與未來展望 52結論 52未來展望 52參考文獻 55圖目錄圖 2-

1、共軛焦顯微鏡光路。5圖 2 2、SPIM掃描樣本示意圖。7圖 2 3、共軛焦顯微鏡與SPIM激發和偵測示意圖[4]。7圖 2 4、搭配振鏡掃描示意圖。8圖 2 5、SPIM掃描腫瘤球體生長情形[11]。8圖 2 6、組織透明化小鼠心臟。 10圖 2 7、掃描方法比較及示意圖[24]。 12圖 2 8、小鼠腦部掃描結果圖[24]。 12圖 3 1、SPIM架構光路圖。 13圖 3 2、樣本與偵測、激發光軸示意圖。 15圖 3 3、SPIM架構實體圖。 15圖 3 4、5x、10x、20x鏡頭下視野大小(Field of view, FOV)及像素大小(Pi

xel size)。 16圖 3 5、俯視及側視SPIM光路圖。 17圖 3 6、推算光源大小示意圖。 18圖 3 8 、反射鏡設置圖。 19圖 3 9、鏡子刮痕圖。 20圖 3 10、照明物鏡焦平面與偵測物鏡焦平面重疊圖。 20圖 3 11、雷射光薄片在光軸不同位置之最大強度投影疊合影像。 21圖 3 12、雷利範圍示意圖。 21圖 3 13、中央部分強度分佈，高斯擬合後結果。 22圖 3 14、5x鏡頭下直徑100nm螢光小球分佈圖。 23圖 3 15、(A)血管影像投影圖，(B)反捲積後結果圖。 25圖 3 16、螢光小球

x-y方向中央部分強度分佈，高斯擬合後結果圖。 25圖 3 17、螢光小球x-z方向中央部分強度分佈，高斯擬合後結果圖。 26圖 3 18、量化示意圖(a)血管投影圖(b)二值化圖(c)管徑骨架圖(d)血管密度圖(e)管徑大小圖。 27圖 3 19、毛細管置於SPIM觀測實體圖。 28圖 3 20、果蠅培養實體圖。 29圖 3 21、果蠅胚胎實體圖。 29圖 3 22、小鼠灌流插入針頭實體圖。 30圖 3 23、小鼠舌頭實體圖。 31圖 3 24、OCT掃描小鼠舌頭結果圖。 31圖 3 25、小鼠舌頭切片實體圖。 32圖 3 26、樣

本擺放示意圖。 33圖 3 27、樣本與照明軸、激發軸角度示意圖。 33圖 3 28、實驗流程圖。 34圖 4 1、SPIM拍攝果蠅胚胎結果圖 35圖 4 2、SPIM拍攝正常小鼠舌頭H&E染色切片(5X) (scale bar 100µm)。 36圖 4 3、正常小鼠舌頭H&E染色切片(5X) (scale bar 100µm)。 36圖 4 4、SPIM拍攝鱗狀上皮細胞癌小鼠舌頭切片(5X) (scale bar 100µm)。 37圖 4 5、鱗狀上皮細胞癌小鼠舌頭H&E染色切片(5X) (scale bar 100µm)。 37圖 4 6

共軛焦螢光顯微鏡拍攝小鼠舌頭血管結果圖(scale bar 100µm)。 38圖 4 7、樣本擺放與觀測軸為90度角示意圖與結果圖(scale bar 100µm)。 39圖 4 8、樣本擺放與觀測軸為45度角示意圖與結果圖(scale bar 100µm)。 39圖 4 9、 SPIM拍攝小鼠舌頭血管結果圖(scale bar 100µm)。 40圖 4 10、Avizo處理後血管立體圖(scale bar 100µm)。 41圖 4 11、共軛焦螢光顯微鏡拍攝小鼠舌頭淋巴管結果圖(scale bar 100µm)。 41圖 4 12、SPIM拍攝小鼠舌

頭淋巴管結果圖(scale bar 100µm)。 42圖 4 13、四張SPIM影像血管疊合圖(scale bar 500µm)。 43圖 4 14、多張SPIM影像疊合血管圖(scale bar 500µm)。 43圖 4 15、共軛焦顯微鏡掃描小鼠舌頭血管結果圖(scale bar 500µm)。 44圖 4 16、多張SPIM影像疊合淋巴管圖(scale bar 500µm)。 45圖 4 17、共軛焦顯微鏡掃描小鼠舌頭淋巴管結果圖(scale bar 500µm)。 46圖 4 18、(A)SPIM拍攝套色後血管圖(B) SPIM拍攝套色後淋巴管圖

(scale bar 1mm)。 47圖 4 19、SPIM拍攝套色後血管和淋巴管疊合圖(scale bar 1mm)。 48圖 4 20、共軛焦顯微鏡拍攝血管和淋巴管疊合圖(scale bar 1mm)。 49圖 4 21、區分上下血管示意圖。 50圖 4 22、(A)上層血管密度圖(B)內部血管密度圖(C)血管密度數值量化圖。 50圖 4 23、(A)上層血管半徑圖(B)內部血管半徑圖(C)血管半徑數值量化圖。 51圖5 1、小鼠胚胎(a)3D OCT影像(b)SPIM 488nm拍攝具GFP的成熟紅血球細胞(c) SPIM 561nm拍攝PECAM1標

記的內皮細胞(d)結合OCT和SPIM 的3D影像 53圖 5 2、DAPI染色後的人類腦部切片(scale bar 1mm)。 54表目錄表 1 1、SPIM相關應用文獻。 2表 2 1、顯微技術優缺點比較及應用[1]。 9表 2 2、常見澄清試劑特性與比較[23]。 11