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分析克雷白氏肺炎桿菌 CG43S3纖毛表現 - 初步探討Ecp纖毛的功能

為了解決黏度單位cps的問題，作者呂宛馨 這樣論述：

克雷白氏肺炎桿菌為一伺機性感染的病原菌，會造成尿道感染、肺炎、敗血症等症狀，其體表纖毛可專一性黏附於特定宿主細胞或組織上，在決定其初步感染與持續定殖上，扮演重要角色。經分析克雷白氏肺炎桿菌 CG43基因體序列，發現其共有十一套屬 Chaperone-Usher家族的纖毛基因組：包括已被報導的第一型、第三型與Ecp纖毛，及八套功能未明的 kpa、 kpb、 kpd、 kpe、 kpf、 kpg、 kph及 kpi纖毛。本論文首先 以qRT-PCR來分析11套纖毛在轉錄水平的表現在LB以37°C震盪培養下，第三型為主要表現的纖毛，第一型與Ecp纖毛分別為其表現水平的6/10與 3/100，而其他

八套纖毛的表現則幾乎偵測不到；在30°C fimA和ecpA表現降低；另外，第一型纖毛單位蛋白基因fimA剔除株在37°C培養時，可 誘導kpaA、kpbA與kpiA表現，而在30°C下其ecpA轉錄顯著增加；相對的 第三型纖毛的單位蛋白基因mrkA缺失，除了促進第一型纖毛表現外，對其他纖毛表現並無顯著影響。第二部分，希望藉由選殖與大量表現黏附蛋白基因，進一步純化黏附蛋白來尋找其相對應的受器。然而，構築於 pQE-81L表現載體的黏附蛋白基因無法經由T5啟動子誘導表現，改以pET-30a為表現載體時，除了fimH外，mrkD、ecpD及kpdD基因均能被IPTG誘導表現。最後，以啟動子活性及西

方墨點法分析來探討Ecp纖毛表現的最佳條件，結果顯示：ecpR啟動子活性在LB-30°C時較37°C佳；而在DMEM的 ecpR啟動子活性皆高於LB或M9，在rcsB基因缺失下ecpR啟動子活性下降；因為EcpA胜肽抗體只能偵測到大量表現的EcpA，在hns基因突變下，也無法偵測到EcpA的表現，可能是因為沒有找到EcpA胜肽抗體偵測的最佳 條件；進一步建構了ecpA基因剔除株，ecpA基因缺失並不影響莢膜多醣 、胞外多醣的生合成，也不影響FimA或MrkA的表現及生物膜生成，此顯示 Ecp纖毛最佳表現的條件有待確認。

克雷白氏肺炎桿菌CG43S3的CSS-EAL domain蛋白YoaD的功能性探討

為了解決黏度單位cps的問題，作者陳韋潔 這樣論述：

細菌中獨特的二級傳訊分子c-di-GMP是一個可抑制細菌運動性但促進黏附與生物膜生成的重要調節因子，由具有GGDEF結構域的二鳥苷酸環化酶(diguanylate cyclase, DGC）環化提升其濃度，而透過具有EAL結構域的磷酸二酯酶（phosphodiesterases, PDE）水解而降低濃度。本篇研究想了解從糖尿病肝膿瘍患者身上分離的克雷白氏肺炎桿菌CG43中YoaD是否與YjcC和MrkJ同樣帶有PDE酵素活性，並分析其生物活性與其活性的調控。經由西方墨點法和剛果紅染色分析發現：剔除yoaD對克雷白氏肺炎桿菌CG43S3的第三型纖毛主要單位蛋白MrkA及胞外多醣的生成沒有明顯影

響，進一步在具高濃度c-di-GMP的大腸桿菌BW25113yhjH或克雷白氏肺炎桿菌CG43S3yjcC中以異基因回補方式殖入pRK415-yoaD質體，相較於大腸桿菌BW25113yhjH[pRK415]， yoaD的表現能抑制其胞外多醣生成且增加其游泳能力，而在CG43S3yjcC殖入pRK415-yoaD質體，不僅降低胞外多醣的生成也也抑制了MrkA和生物膜生成，這些結果顯示YoaD具PDE活性。為了證實其酵素活性，進而構築了重組質體pET30b-YoaD-EAL並在大腸桿菌BL21(DE3)表現此重組蛋白，經比較分析粗萃液酵素活性發現重組蛋白YoaD-EAL的PDE活性相對低

於YjcC-EAL但高於MrkJ。為了瞭解YoaD是否參與對抗環境壓力反應的調控，進一步以H2O2及pH 2.5來測試YoaD表現對CG43S3yjcC生存率的影響，結果發現yoaD表現能夠提升CG43S3yjcC對抗H2O2或pH 2.5的能力；而為了探討YoaD-CSS motif是否扮演接收外部環境的角色，因此建構了定點突變的重組質體pRK415-YoaD-C109R和pRK415-YjcC-C106R，經回補實驗分析發現YoaD定點突變對克雷白氏肺炎桿菌表現型沒有影響，但YjcC點突變增加其MrkA和胞外多醣的生成；而兩者的點突變皆會降低菌株在H2O2刺激下的存活率；此外，YoaD

的表現可增加大腸桿菌XL1-MRP2對P1噬菌體的耐受性。最後，以LacZ作為報告子的啟動子活性分析顯示yoaD的表現可受弱酸和paraquat誘導，而比較yoaD與yjcC啟動子表現發現兩者皆受RpoS正向調控，然而yjcC表現會受弱酸環境所抑制，此暗示弱酸環境可能是決定YoaD 與YjcC二者表現差異的因子。