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利用透明質酸備製聚電解質多層膜進行無標記篩選與擴增肝臟癌症幹細胞

為了解決100 90 r10 ptt的問題，作者莊竣傑 這樣論述：

目錄指導教授推薦書口試委員會審定書中文摘要......... iii英文摘要..........v目錄................ vii圖目錄...............x表目錄............ xii第一章 序論 11.1　前言 11.2　研究動機與目的 11.3　實驗架構 3第二章　相關研究與文獻 42.1 癌症幹細胞 42.1.1　癌症幹細胞之特性 42.1.2　微環境(microenvironment)對癌症幹細胞的影響 72.1.3　目前三種篩選癌症幹細胞的方法 82.1.3-1　抗體磁珠標定細胞表面

的特異性蛋白 82.1.3-2　活體螢光染劑分選低殘留量之細胞 92.1.3-3　放射線照射後有部份細胞進行DNA修復 92.2　肝臟癌症幹細胞與肝癌 102.2.1　引起肝癌的途徑 102.2.2　目前肝癌治療方式與瓶頸 102.2.3　肝臟癌症幹細胞標記 112.2.4　細胞聚落的特性 122.2.5　透明質酸(hyaluronan, HA)對癌症的影響 132.3　聚電解質多層膜(Polyelectrolyte Multilayer Films, PEM) 162.3.1　聚電解質多層膜特性與相關應用 162.3.2　聚電

解質多層膜逐層塗佈之結構影響 172.3.3　聚電解質多層膜應用於細胞培養與其影響因素 18第三章　材料與方法 213.1　原料與藥品 213.2　藥品配製 223.3　儀器設備 233.4　玻璃片前處理及聚電解質溶液配置 243.4.1　玻璃片前處理 243.4.2　正電之聚電解質溶液-PAH 253.4.3　負電之聚電解質溶液-HA 253.4.4　PAH、HA溶液製備 253.5　HA 單層備製過程 253.6　聚電解質多層膜逐層塗佈之流程 253.7　石英微量天秤(QCM) 273.8　細胞培養及型態觀

察 273.8.1　肝臟癌症細胞株(Huh-7)的培養 273.8.2　以聚電解質多層膜篩選肝臟癌症幹細胞之最適化評估 273.9　生化分析 283.9.1　MTT細胞活性分析 283.9.2　LDH細胞毒性分析 283.9.3　Live/Dead活性分析 293.9.4　聚電解質多層膜篩選之癌症幹細胞表面標記分析 303.9.5　抗癌藥物敏感度與抗藥性測試 303.9.6　RT-q-PCR檢測特異性基因 31第四章　實驗結果與討論 344.1　石英微量天秤之吸附測試 344.2　 Huh-7於不同濃度單層的透明質酸之細胞

型態 364.2　Huh-7於不同濃度組成的聚電解質多層膜之細胞型態 374.3　Huh-7於濃度3mgl/mL組成的聚電解質多層膜之細胞型態 394.5　生化分析 424.5.1　MTT之分析與探討 424.5.2　LDH之分析與探討 434.5.3　Live/Dead之分析與探討 454.5.4　Huh-7於(PAH/HA)第3、5、7天之特異性細胞表面蛋白分析 464.5.5　Huh-7於(PAH/HA)第3天與第7天之抗癌藥物分析 574.5.6　特異性基因表現之分析 59第五章　結論 61參考文獻 63圖目錄圖1

　實驗架構 3圖2　聚電解質多層膜逐層塗佈步驟示意圖 26圖3　石英微量天秤震盪頻率分析圖 34圖4　 Huh-7於不同濃度HA之細胞形態(100X，scale bar = 50μm) 36圖5　 Huh-7 於PAH/HA培養5天後之細胞形態(100X，scale bar=50μm) 37圖6　Huh-7於系列PAH/HA培養後之細胞形態(100X，scale bar=50μm) 40圖7　Huh-7 於(PAH/HA)3.0第3、5、7天之三維球狀大小與菌落數 40圖8　Huh-7於系列PAH/HA培養3天與7天後之細胞活性分析圖 42圖9　

Huh-7於系列PAH/HA培養3天與7天後之細胞毒性分析圖 44圖10　 Huh-7於系列PAH/HA之Live/Dead螢光檢測圖(scale bar = 50μm) 46圖11　Huh-7於控制組第3、5、7天之CD133/CD44雙染圖 47圖12　Huh-7於(PAH/HA)1.0第3、5、7天之CD133/CD44雙染圖 47圖13　Huh-7於(PAH/HA)2.0第3、5、7天之CD133/CD44雙染圖 47圖14　Huh-7於(PAH/HA)3.0第3、5、7天之CD133/CD44雙染圖 48圖15　Huh-7於控制組第3、5、7天之E

pCAM/CD133雙染圖 50圖16　Huh-7於(PAH/HA)1.0第3、5、7天之EpCAM/CD133雙染圖 50圖17　Huh-7於(PAH/HA)2.0第3、5、7天之EpCAM/CD133雙染圖 51圖18　Huh-7於(PAH/HA)3.0第3、5、7天之EpCAM/CD133雙染圖 51圖19　Huh-7於控制組、(PAH/HA)1.0、2.0、3.0第3、5、7天之CD133/CD44雙染圖(*P

聚電解質多層膜無標記篩選肝臟癌症幹細胞

為了解決100 90 r10 ptt的問題，作者張仁輔 這樣論述：

肝癌是國內十大死因之一，而大部分早期肝癌患者進行化學治療與輻射線治療時，療效有限。此外，由於缺乏高專一性和高敏感性的標記，肝癌在早期診斷與處理仍有困難。癌症幹細胞證實是許多實質腫瘤的來源，因此許多近期的腫瘤研究以癌症幹細胞為新導向，期望發展新的癌症治療方向。在生醫材料領域中，以逐層塗佈技術所組成的聚電解質多層膜可調控材料表面性質的變化，進而影響細胞行為。因此，系列聚電解質多層膜材料，可藉由材料的選擇與塗佈層數來調控微環境的變化，影響細胞形態的改變與其貼附方式。我們過去研究發現，聚電解質多層膜逐層塗佈技術具有篩選肝臟幹細胞/前驅細胞的成效，因此我們認為在微環境調控下有助於篩選出聚集的癌症細胞球

。本研究的目的是以玻璃為基材，將具正電性的聚丙烯胺氫氯化物(poly(allylamine hydrochloride), PAH)與帶負電的聚苯乙烯磺酸鈉(poly(sodium 4-styrene sulfonate), PSS)以逐層交錯的方式進行塗佈，製備系列聚電解質多層膜。再將肝臟癌症細胞株Huh7培養在此多層膜所構築的系列微環境，期望建立一個無標記的篩選系統，以達到篩選肝臟癌症幹細胞的目的。實驗方面，首先以石英微量天平分析確定系列聚電解質層膜的震盪頻率與緻密度。此外，利用光學顯微鏡觀察，篩選出肝臟癌症細胞聚落的聚電解質多層膜條件。進一步分析細胞毒性並以流式細胞儀分析在不同層數所篩選

的癌症幹細胞標記，包含CD133、CD44、EpCAM之雙染表現量以及觀察細胞週期的進展，進而做統計分析。結果顯示，在材料為(PAH/PSS)4-PAH及(PAH/PSS)6-PAH的層數下，細胞培養至第5天有明顯細胞聚集效果，進一步以流式細胞儀測定所篩選細胞之表面標記比例。發現隨著天數的增加，以(PAH/PSS)4-PAH及(PAH/PSS)6-PAH所篩選之細胞群高度表現CD133/CD44雙染標記，其百分比也會隨培養時間持續增加。而在藥物敏感性實驗中，加入抗癌藥物doxorubicin進行藥物敏感性測試，其中以上述兩種條件所篩選之細胞群落細胞數不會隨藥物濃度提升而下降。在細胞週期分析中則

是發現所篩選之細胞群多停留於合成期階段，可能具細胞擴增潛力。本研究利用一系列聚電解質多層膜創造系列微環境的變化以篩選及分離癌症幹細胞，並探討聚電解質多層膜表面特性對微環境及肝癌幹細胞篩選之的影響，未來將有助於應用於肝癌藥物篩選與治療肝癌的新策略。