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第一章: 線蟲三聯複合體RAB-3-UNC-10-SYD-2之活性區調控驅動蛋白-3 UNC-104的作用角色 第二章: PKG-1與GCK-2 能調節線蟲感覺神經之纖毛長度與鞭毛內運輸 第三章: 線蟲中似神經絲蛋白TAG-63能促進神經軸突傳遞機制

為了解決2014 CLA250 PLUS的問題，作者沛蕊娜 這樣論述：

Abstract I神經細胞體中合成的突觸蛋白經由微管依賴馬達沿軸突將蛋白運輸至其各自的目的地。UNC-104是線蟲中KIF1A的同系物，為運輸突觸小泡前體必需物。 它的C終端PH結構區域可以特異地與囊泡膜上的酸性磷脂（PI（4,5）P2）直接結合，並將馬達和貨物連結起來。 然而，我們假設UNC-104之PH域與貨物的聯繫很微弱，並且可能不足以用於捆綁和識別貨物。有趣的是，研究已經顯示RIM / unc-10在C端表現了Liprinα/ syd-2的結合位點，而其N端與Rab3 / RAB-3結合。 因此，我們推斷增加連接RAB-3 / UNC-10 / SYD-2，以提高馬達-貨物的連通性

和強度。為了證明我們提出的連接子存在，我們首先進行即時PCR分析，指出unc-10突變體中SYD-2增加表現量，而其在rab-3突變體中明顯降低。此外CO-IP實驗鑑定出unc-10突變體和rab-3突變體中會降低SYD-2與UNC-104的結合能力。在unc-10和rab-3突變體中，UNC-104集群區域也受到嚴重影響。 SYD-2和UNC-104在線蟲神經元中彼此共定位。然而此共定位在unc-10和rab-3突變體中大大減少。且類似地，UNC-104和SYD-2相互作用的BiFC信號分佈模式也分別在unc-10和rab-3突變體中降低。此外，三種活性區域蛋白(syd-2，unc-10和r

ab-3) 突變體中，UNC-104運動能力均受到強烈影響。另外對於含有RAB-3的囊泡觀察到類似的運動模式，表明RAB-3運輸需要SYD-2 / UNC-10結合，但SNB-1則無需。同樣地，在軸丘中RAB-3行進距離在syd-2和unc-10突變體中都受到影響，但SNB-1僅在syd-2突變體中受影響。而從另一種方法，我們試圖了解與SNB-1和UNC-104相比，RAB-3和UNC-104之間額外連接點是否存在，當去除PH結構域時有較低的共定位程度影響。事實上，當去除PH區時，SNB-1和UNC-104之間的共定位有強烈影響，而RAB-3和UNC-104共定位則無。相應地，在syd-2和u

nc-10突變體動物中，UNC-104（缺失PH結構域）和RAB-3共定位明顯減弱。RAB-3和SNB-1在BiFC分析中也表現出輕微的相互作用，並且這種複合體進一步與體內UNC-104共定位。 從我們的研究中，我們得出結論認為要加強SYD-2與UNC-104的聯繫，需要UNC-10 / RAB-3複合體存在，而進一步增強馬達與貨物的連接性。Abstract II過多的人類疾病是來自於纖毛功能障礙，包括多囊性腎病變，Bardet- Biedl和Meckel-Gruber綜合症。幸運地，近幾年來纖毛發育和鞭毛內運輸（IFT）的基礎機制更加清楚明瞭。然而在纖毛機制被解開的同時，也產生了許多出現新的

問題，尤其是IFT貨物如何在纖毛基部組成、如何定位纖毛、以及如何調節“IFT列車”。最近有個令人感興趣的研究，兩種線蟲激酶DYF-5和DYF-18的纖毛調節功能被找出來，我們推測應該還能發現許多激酶與磷酸酶。我們因此使用資料探勘的工具，來鑑定線蟲纖毛感覺神經元中特定表達之激酶和磷酸酶。使用廣泛的方法來探討已選定的激酶和磷酸酶對纖毛形成和IFT的影響，例如染劑填充，化學趨化性，IFT組成表達模式，並確定PKG-1和GCK2 為可能的候選蛋白且明顯影響纖毛發育和貨物運輸。在pkg-1突變中一同被發現到，驅動蛋白2 OSM-3同源二聚體在纖毛末梢大量積累並降低纖毛動力蛋白XBX-1逆行速度，導致異常

纖毛形態，且可能伴隨減少纖毛微管蛋白乙酰化。而在gck-2突變體中，OSM-3和IFT-顆粒A（CHE-11）運動性隨著微管蛋白乙酰化的增加而明顯升高，降低KAP-1運動性，證實最近的模型，KAP馬達限制了OSM-3運動。最重要的是，我們觀察到突變體動物都可以利用過度表達PKG-1或GCK-2蛋白來挽救這些缺陷（在纖毛特異性Posm-5啟動子下）。 由於PKG-1和GCK-2與IFT之組成元件的共定位，兩種蛋白在纖毛中都遵循相似的表達模式以及表現運動。PKG-1與cGMP途徑有關，我們分別研究了上游效應物DAF-11和ODR-1的影響，發現與pkg-1突變體具有相似的結果。相反地，GCK-2與

mTOR途徑有關，所以我們使用雷帕黴素來抑制該途徑，也發現與gck-2突變體中所見的影響相似。有趣的是，我們還利用組蛋白脫乙酰酶HDA-4和SIR-2.1來了解調節cGMP和mTOR途徑中的作用角色。簡要來說，我們描述以及確定了兩種新穎激酶的獨特功能，來影響秀麗隱桿線蟲的纖毛形成和鞭毛內運輸。Abstract III有發現不同的神經疾病包含帕金森病，肌萎縮性側索硬化症，Charcot-Marie-Tooth疾病和Tau蛋白病都與神經絲(NF’s)缺陷有關。神經病理學中已經確定NF的角色與作用，但對於這些疾病在分子層級是如何發展的知識仍甚少，是促進未來藥物設計的重要關鍵。模式生物例如斑馬魚、果蠅

、線蟲，都有被利用研究這些疾病的發展，然而在線蟲中是否存在NF同原物仍然不清楚。因此，我們的目標主要是辨識與描繪線蟲假定的似NF蛋白。使用生物資訊工具我們鑑定了與NEFH (BLAST e值為 5E-09) 於三螺旋以及各種磷酸化位點有高度同源性的TAG-63，並採用廣泛技術，例如西方墨點法、穿透式電子顯微鏡、線蟲成像、運動分析來描摹TAG-63在線蟲的角色。為了鑑定NF同源物，KEGG數據庫提供了來自多種動物的NEFH同源基因。生物資訊工具顯示後，我們注意到一群NEFH直系同源基因在來自一般TAG-63祖先根源。雖然我們沒有辦法檢測到KSP重複序列，但利用Scansite工具我們確定了9個潛

在的磷酸化位點。此外，捲曲螺旋預測工具在TAG-63中發現了三個潛在的捲曲螺旋。為了理解TAG-63是否在神經元組織中表達，我們製作了轉錄TAG-63報告能在廣泛的身體，頭部和尾部神經元中表現。最重要的是，TAG-63還具有NF-L的特徵，例如分子量約70kDa，缺乏KSP重複序列和在透射式電子顯微鏡下觀察時呈現絲狀結構。此外有研究指出，NF’s會影響軸突運輸，我們調查敲除tag-63對突觸小泡運輸的影響。發現TAG-63突變體動物中UNC-104的順行運輸明顯減少，指出TAG-63的激活馬達運動之作用。雖然我們沒有得到UNC-104與貨物SNB-1有類似的影響，但我們測量後發現這種貨物有增加

逆行運動。而且tag-63缺陷線蟲的UNC-104速度與流量顯著減少，另一方面，tag-63突變體中SNB-1在細胞體中螢光強度增強，但在靠近HSN神經突觸區域減少。總之，我們在線蟲中鑑定並表徵了似NF蛋白質，並且還證明缺乏這種蛋白會限制軸突運輸效率，表明這種模型生物體可以用於研究有關神經絲的神經疾病。