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日本腦炎病毒複製過程中細胞骨架與病毒蛋白質相關性的探討

為了解決2023入秋的問題，作者邱俊棠 這樣論述：

日本腦炎病毒是一種利用蚊子傳播的黃質病毒。日本腦炎病毒所引起的日本腦炎每年都會在印度、中國大陸以及東南亞等地區廣泛地流行。因此，日本腦炎病毒的防治與疫苗的發展是現今公共衛生的主要課題之一。日本腦炎病毒利用接受器媒介的內吞作用進入細胞，在細胞核附近的膜狀構造中大量製造其蛋白質與RNA，進而組裝成完整的病毒顆粒，利用分泌路徑釋放到細胞外。許多報告指出細胞骨架在病毒複製的過程中扮演非常重要的角色，然而在日本腦炎病毒相關的研究中，迄今並沒有細胞骨架對日本腦炎病毒複製過程的影響的報告。此外，已知對病毒的組裝與釋放非常重要的TSG101蛋白質可能位在病毒引發的膜狀構造中，顯示TSG

101可能也参與日本腦炎病毒的複製。本論文的目的就是要探討細胞骨架與TSG101在日本腦炎病毒的複製過程中可能扮演的角色。首先，我們探討干擾細胞骨架的藥物對日本腦炎病毒複製的影響。日本腦炎病毒複製會誘使細胞內膜狀構造，包括膨大的顆粒內質網、平滑膜狀構造以及膜狀小泡構造等增生。在加入秋水仙素或cytochalasin B打斷微小管與微絲的結構並不會影響這些膜狀構造的形成。然而，我們在秋水仙素處理的細胞中，大量日本腦炎病毒堆積在液胞中，而利用溶菌斑分析病毒效價發現病毒的釋放也有延遲的現象。這個結果顯示完整的微小管可以加速日本腦炎病毒的釋放。我們也發現到有日本腦炎病毒的顆粒從膜狀小泡構造的邊緣出芽的

情形，顯示膜狀小泡構造可能是一個日本腦炎組裝的地方。其次，我們分析病毒蛋白質和細胞骨架和 TSG101 的連接。利用1% Triton X-100將細胞蛋白質分成清潔劑可溶與不可溶兩個部份時，可以發現日本腦炎病毒NS3與套膜蛋白質都只分布在清潔劑不可溶的部份。這個結果顯示日本腦炎病毒非結構性蛋白質NS3與套膜蛋白質可能與細胞骨架連接。利用免疫螢光法、免疫沉澱法以及免疫焦基金標示法發現NS3與套膜蛋白質和微小管與TSG101連接在一起，而且都位在膜狀小泡構造上。此外，日本腦炎病毒複製的過程中也會誘導微小管重組，使微小管在細胞核附近形成聚集。這種使微小管在細胞核附近形成聚集的現象也出現在只有表現N

S3的細胞。這個結果顯示NS3可能是日本腦炎病毒複製過程中誘使微小管重組的蛋白質之一。最後，我們根據NS3的主要功能分成蛋白酶與解螺旋酶兩部份，並與自發螢光的蛋白質GFP形成融合蛋白，藉此了解NS3與微小管連接的部份。利用DEAE-dextran方法將融合蛋白的表現載體送到COS-1細胞中表現。只表現GFP時，發現螢光均勻的分布在細胞質與細胞核中。若表現NS3蛋白酶與GFP融合蛋白，發現螢光在細胞質中形成小的點狀聚集，顯示NS3蛋白酶部份可能有寡體化的現象。以上兩者與微小管並無共同分布的現象。然而，NS3全段或解螺旋酶與GFP的融合蛋白都顯示與微小管共同分布的情形，顯示與微小管連接的為NS3的

解螺旋酶部份。觀察NS3全段與GFP融合蛋白螢光表現的情形，可以發現螢光在轉染第二天會在細胞核附近形成大的聚集。在此同時，微小管也存在於這些螢光的聚集中，顯示NS3可以改變微小管的結構。我們的結果顯示日本腦炎病毒在複製時，微小管以及TSG101可能參與病毒的組裝與釋放。