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探討bradykinin對鼠腦星狀細胞株RBA-1之細胞及生理功能的影響

為了解決HR-V 2021的問題，作者謝喜龍 這樣論述：

Bradykinin (BK) 是一種發炎中間物質，研究發現 BK 在許多腦部損傷與病變上會大量的產生，且 BK 可引發腦部細胞許多蛋白表現像是 matrix metalloproteinases (MMPs)，因此 BK 可能參與腦部病變或發炎反應；無論如何，在腦部星狀細胞 (rat brain astrocyte-1；RBA-1) 上， BK 是否誘發 MMP-9 表現及其機轉仍未知。因此，在第一節我們擬探討 BK 刺激 RBA-1 細胞 MMP-9 表現之分子機轉為何。 由 zymography、Western blotting 及 RT-PCR 的結果顯示 BK

可刺激 RBA-1 細胞 MMP-9 mRNA 及蛋白質表現，且此表現呈現一時間及濃度依存性，研究發現這反應可被 MEK1/2 抑制劑 PD98059、PI3-K 抑制劑 LY294002 及 NF-κB 抑制劑 helenalin 所抑制。我們也發現 BK 可刺激 p42/p44 MAPK、Akt 磷酸化及 NF-B 活化，而 PD98059、LY294002 及 helenalin 皆可抑制 NF-B 活化；此外，這些反應皆能被 B2 BK 接受器的拮抗劑 Hoe140 所抑制，以 [3H]-BK 結合分析與免疫螢光染色法皆證實 RBA-1 細胞上表現 B2 BK 接受器。此外，以 H

oe140、PD98059、LY294002 及 helenalin 前處理細胞也皆可抑制 NF-B 的核轉位作用。由這部份結果推測在 RBA-1 細胞上，BK 可經由刺激 p42/p44 MAPK 及 Akt 活化，進一步造成 NF-B 的核轉位作用而促使 MMP-9 表現。 先前文獻指出 p42/p44 MAPK 在許多細胞功能上扮演一重要的居中調控因子，所以接下來我們欲探討 BK 刺激 RBA-1 細胞 p42/p44 MAPK 活化的詳細機轉。首先，我們發現 B2 BK 接受器的拮抗劑 Hoe140、pertussis toxin (PTX)、cholera t

oxin (CTX)、phosphatidylinositide-phospholipase C (PI-PLC) 抑制劑 U73122、phosphatidylcholine (PC)-PLC 抑制劑 D609、Ca2+ 螯合劑 BAPTA/AM 加 EGTA 及可造成內質網內 Ca2+ 空乏的 thapsigargin (TG)、protein kinase C (PKC) 抑制劑 staurosporine 與 GF109203X 及藉由以 PMA 處理 24 小時而促使 PKC down-regulation、以 dominant-negative Ras 及 Raf1 轉殖進細胞及

MEK1/2 抑制劑 PD98059 與 U0126 皆可抑制 BK 刺激 p42/p44 MAPK 磷酸化。而且我們以 Fura-2/AM 作為偵測胞內 Ca2+ 變化的螢光染劑，結果發現 BK 可刺激細胞內 Ca2+ 上升，且此 Ca2+ 是經由胞內 TG-sensitive Ca2+ stores 釋放出的；另外，我們也發現 BK 可誘使 RBA-1 細胞 PKC 轉位至細胞膜，其中包括: PKC-, -I, -, -, -, - 及 - isoforms，而以 PKC- 專一性抑制劑 rottlerin 可抑制 BK 刺激 p42/p44 MAPK 磷酸化；實驗中我們以

phospho-tyrosine 抗體及免疫沉澱發現 BK 可刺激某些 protein tyrosine kinases 磷酸化像是 proline-rich tyrosine kinase (PYK2)、Src family kinases 及 SHC，且這些蛋白可形成複合體；我們更發現 BK 也可刺激 JNK 至 c-Jun 的路徑及 p42/p44 MAPK 的核轉位作用。綜合這部份結果顯示 BK 刺激 RBA-1 細胞 p42/p44 MAPK 磷酸化是經由一 Ras- 及 Raf1-dependent 途徑，其中依序經由 PTX-sensitive G 蛋白偶合 B2 BK 接受器

活化 PI-PLC、PC-PLC、Ca2+、PKC (PKC-) 至 PYK2/c-Src/SHC 複合體。 星狀細胞在腦部正常及病變生理上扮演一重要角色，文獻指出許多刺激物可調控星狀細胞的各種生理功能，包括: 增生、遷移及基因表現等。因此，最後一節我們將廣泛探討 BK 對於 RBA-1 細胞其他生理功能的影響，由 [3H]-thymidine 嵌入及啟動子分析方法得知 BK 刺激並不影響增生反應，但可促使轉錄因子 NF-B 及 AP-1 的轉錄活性，進而可影響某些基因的表現像是 inducible nitric oxide synthase (iNOS)、cPLA2

及 cyclooxygenase 2 (COX-2)，在 mRNA 及蛋白質表現皆成一時間依存性；另外，我們以 ELISA kit 也偵測到 BK 可刺激 prostaglandin E2 釋放。除此之外，我們更得到許多意外的結果，除了之前發現 BK 刺激 PYK2 活化外，我們發現 BK 可刺激 focal adhesion kinase (FAK) 的去磷酸化、細胞的遷移及形態改變等；之後，我們更發現 BK 可造成 RBA-1 星狀細胞特有標識蛋白 glial fibrillary acidic protein (GFAP) 的 down-regulation 及誘使神經標識蛋白 neur

on-specific enolase (NSE) 的表現，故推測 BK 可能誘使 RBA-1 細胞的類神經分化作用。 綜合以上研究結果，將提供在中樞神經系統致病上，調控 MMP-9 表現的參考資料，此外 BK 刺激某些基因或蛋白的表現、遷移及分化結果，也將可提供在治療因 BK 所引發的腦部疾病上之重要參考。