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靜宜大學 食品營養研究所 張珍田、林榮流所指導 陳湘玲的 大腸桿菌NovaBlue重組雙胜肽羧基胜肽酶之生化特性研究 （2010），提出Hyt1107關鍵因素是什麼，來自於血管升壓素轉換酶、基質專一性、Captopril、圓二色光譜、選位突變技術、Escherichia coli 雙胜肽羧基胜肽酶。
大腸桿菌NovaBlue重組雙胜肽羧基胜肽酶之生化特性研究
為了解決Hyt1107 的問題，作者陳湘玲 這樣論述：
哺乳類動物負責維持血壓恆定的血管升壓素轉換酶 (angiotensin converting enzyme, ACE) ，是大家最熟知的雙胜肽羧基胜肽酶。源自於Escherichia coli 的雙胜肽羧基胜肽酶 (EcDCP) 之基因開放讀碼框 (open reading frame)為 2,043 bp可轉譯681個胺基酸。EcDCP之性質與哺乳類的ACE相似，為大量表現E. coli NovaBlue 雙胜肽羧基胜肽酶，將EcDCP基因以PCR增幅構築至表現載體pQE-31形成重組之pQE-EcDCP質體，以E. coli M15為宿主細胞在0.05 mM IPTG 26 ℃條件下誘導
表現18小時，可大量表現出具可溶性的活性酵素His6-EcDCP。重組His6-EcDCP以Ni2+-NTA親和性管柱一步純化後以SDS–PAGE分析，可得到分子量約為75 kDa 之重組酵素，His6-EcDCP的pI值為5.22。His6-EcDCP之最適反應溫度及pH值分別為37 ℃及pH 7.0。以N-benzoyl-L-glycyl-L-histidyl-L-leucine (HHL)為基質時，測得比活性值為23.52 ± 2.6 U/mg，動力學參數KM及kcat值分別為1.83 mM 及 168.3 s-1。 金屬離子Co2+ 及Mn2+可顯著增加His6-EcDCP的活性，但
Ni2+離子、10 mM EDTA、0.25 mM 1.10-phenanthroline及 2.5 mM DEPC對His6-EcDCP活性具有強烈的抑制作用；Ser、Asp、Lys及Trp之蛋白酶修飾劑不會影響His6-EcDCP活性。以圓二色光譜於25 mM Tris-HCl, pH 7.0緩衝液條件下分析，顯示His6-EcDCP的二級結構由17% α-螺旋 (helix)，35% β-平板 (sheet) 及47% 隨意螺旋 (random coil)組成。對於重組之His6-EcDCP其熱轉換(thermal transition )中點溫度為55℃。為了研究重組之His6-EcD
CP結構及功能，本研究以選位突變後的蛋白質表現，期望從基因上仔細分析酵素以了解催化作用的機制。以SDS–PAGE分析突變酵素之分子量約為75 kDa。將His6-EcDCP的胺基酸序列與其它同源性蛋白質比較，顯示其活化位置具有一般含鋅金屬胜肽酶的HEXXH的專區，推論Glu 499與His 470及His 474一致，可直接與活化位置的鋅離子配位鍵結，作為的鋅離子第三個配位基。當這些胺基酸被改變會導致His6-EcDCP對N-benzoyl-L-glycyl-L- histidyl-L-leucine的活性完全喪失，對於F472V及F500V突變酵素其催化活性亦明顯下降。以內在色胺酸螢光光譜顯
示所有的突變酵素其芳香性胺基酸的微環境明顯改變，但所有突變酵素的圓二色譜幾乎完全相同。H470R、E471D、H474R、E499D及 F500V 所有突變酵素配位之Zn2+量明顯降低，可能是造成這些突變酵素失去催化活性的因素。根據結果推測His470、Glu471、His474、Glu499及Phe500是維持活化位置環境穩定的必要胺基酸殘基，根據這些結果可以對於His6-EcDCP的催化機制更加充分理解。以合成之2-furanacryloyl (FA)-胜肽探討His6-EcDCP的基質專一性，His6-EcDCP對於游離的FA-雙胜或C-端包覆FA-胜肽無法水解。對於FA-三胜肽其KM值
介於0.2-13.5 mM間，以 FA-Phe-Ala-Phe為基質時KM值最低，kcat/KM值以FA-Phe-Ala-Phe的5246 mM-1 sec-1為最高。酵素活性似乎由P1胺基酸決定，其活性關係為 Phe > Leu > Ala > Gly；活性與P1′ 或 P2′.胺基酸種類較無關。基質的P1′ 胺基酸為Gly其kcat值最低，P2′ 胺基酸是Phe其KM值最低。以生物活性胜肽為基質時，angiotensin I的kcat/KM值 (114 mM-1 sec-1) 最低，His6-EcDCP以bradykinin 為基質時其催化效率是 angiotensin
I的3倍。angiotensin I之 kcat /KM值與ACE相近。 His6-EcDCP以 bradykinin 為基質時其KM值最低，且重組酵素不會與substance P反應。根據這些結果推測重組之His6-EcDCP 與哺乳類的ACE具有相似的基質專一性。為了評估ACE抑制劑對His6-EcDCP活性的影響，以ACE 抑制劑captopril、六種合成ACE抑制胜肽及大豆蛋白水解液多胜探討其對His6-EcDCP抑制作用。以HHL及FA-Phe-Gly-Gly為基質時Captopril對His6-EcDCP之IC50值分別為21nM及16.5 nM，Captopril的抑制效用受基
質之影響，當基質不同時其抑制亦程度不同，且根據Lineweaver-Burk動力學作圖結果顯示不論以HHL及FA-Phe-Gly-Gly為基質時Captopril抑制均屬於競爭型抑制作用，其ki值分別為5.2 nM及9.9 nM。以HHL為基質時六種合成抑制胜肽-Thr-Val-Tyr、Val-Ala-Pro、Ile-Pro-Pro、Leu-Arg-Tyr、Leu-Lys-Tyr、Asp-Leu-Pro IC50值分別為 12.4、6.0、9.2、 0.8、0.2 、5.7 μM，以Leu-Lys-Tyr 抑制效率最佳。Alcalase水解大豆所得之水解液多胜肽之IC50為0.22 mg/mL
。結果顯示ACE抑制劑或ACE抑制多胜對His6-EcDCP的抑制作用與ACE相似。