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以db/db糖尿病小鼠模式探討調節血糖與穩定血糖之研究：以Akkermansia muciniphila菌與高壓加工果汁為例

為了解決Kawasaki B1 整理的問題，作者呂沂靜 這樣論述：

糖尿病之定義為一種慢性的代謝異常疾病，主要原因是由於體內胰島素缺乏或功能不全，而對醣類的利用及調節能力下降。台灣地區糖尿病型態以第二型糖尿病 (type 2 diabetic mellitus, T2DM) 為主，約占罹患率的95%左右，若長期血糖控制不佳，容易引起相關併發症，所以，如何穩定血糖成為近年重視與努力的健康議題之一。因此，本研究利用機能性素材探討其在調節血糖之作用，期望將其開發成具穩定血糖之保健食品。內容主要分成兩部分：(一) 利用db/db糖尿病小鼠模式探討Akkermansia muciniphila (A. muciniphila) 調節血糖及腸道菌相之功能 (二) 以 d

b/db 糖尿病小鼠模式探討高壓加工果汁在穩定血糖之研究(一) 本研究以自行分離之A. muciniphila活菌與死菌作為研究介入之細菌，探討其是否具有調節血糖之作用，並探討其對腸道菌相變化之影響。使用5週齡C57BL/KSJ正常小鼠與db/db糖尿病小鼠，將動物隨機分組 (n=7/組)，分別有：(1) 控制組 (wild-type, WT)、(2) db/db糖尿病小鼠 (diabetes mellitus, DM)、(3) db/db糖尿病小鼠給予A. muciniphila活菌 (Akkermansia muciniphila-live, DM+AKK-L)、(4) db/db糖尿病小

鼠給予A. muciniphila死菌 (Akkermansia muciniphila-dead, DM+AKK-D)，以及 (5) db/db糖尿病小鼠給予AKK標準菌株ATCC BAA-835 (Akkermansia muciniphila-positive, DM+AKK-P)，每隻小鼠每天給予1x108 CFU/mouse/day菌數，實驗為期八週。由實驗結果顯示，給予A. muciniphila各組別之最終體重皆顯著增加，並且顯著增加棕色脂肪組織含量。給予A. muciniphila各組之空腹血糖，皆顯著低於DM組。給予DM+AKK-L組可顯著降低db/db糖尿病小鼠之血清中總膽

固醇與低密度脂蛋白膽固醇。在短鏈脂肪酸部分，給予DM+AKK-L組可顯著增加糞便乙酸之含量；給予DM+AKK-D組，可顯著增加糞便丁酸之含量。綜合以上結果得知，給予A. muciniphila菌具有調節血糖之潛力，其中AKK-L之作用最佳。(二) 本研究以db/db糖尿病小鼠模式探討紅甘蔗、白甘蔗和鳳梨高壓加工 (600 MPa/ 5 min) 果汁對於穩定血糖之作用。將雄性 db/db 糖尿病小鼠 (n=6/組)與C57BL/KSJ正常小鼠 (n=8/組) 分為8組，分別給予單純葡萄糖水不同種類之未高壓與高壓加工之果汁，包括：正常小鼠 (wild type, WT)、db/db糖尿病小鼠 (

Diabetes Mellitus, DM) 以及分別給予未高壓與高壓加工之紅甘蔗汁 (red sugarcane juice, RSJ)、白甘蔗汁 (white sugarcane juice, WSJ)、鳳梨汁 (pineapple juice, PJ) 之組別，待糖尿病小鼠空腹血糖達 300 mg/dL後，進行一次性口服葡萄糖耐受試驗 (Oral glucose tolerance test, OGTT)。由實驗結果得知，相較於給予葡萄糖水之DM組別，給予高壓加工之白甘蔗汁、紅甘蔗汁與鳳梨汁之組別，可顯著降低OGTT曲線下面積，以及抑制果汁中α-葡萄糖苷酶和蔗糖轉化酶之活性。綜合上述結果

可知，經高壓加工之果汁可抑制果汁酵素，延遲葡萄糖分解，從而延緩小腸對葡萄糖之吸收，具有穩定血糖之作用。

白蝦菌株之篩選及其降解蝦殼廢棄物能力之探討

為了解決Kawasaki B1 整理的問題，作者陳怡靜 這樣論述：

壹、前言 -------------------------------------------1貳、文獻整理 ---------------------------------------3一、蝦廢棄物 ---------------------------------------31. 蝦殼構造 ----------------------------------------32. 蝦廢棄物化學組成 ---------------------------------42.1 化學組成 ---------------------------------------42.3 蝦紅素 ----

-------------------------------------53. 蝦廢棄物之利用 ----------------------------------53.1 幾丁質 -----------------------------------------53.2 酵素 -------------------------------------------73.3 肥料及飼料 -------------------------------------73.4 食品 -------------------------------------------73.5 活性胜肽 -------

--------------------------------73.6 抗氧化劑 ---------------------------------------83.7 清潔劑 -----------------------------------------83.8 抗植物病原菌 -----------------------------------8二、微生物法降解蝦廢棄物 ----------------------------81. 乳酸菌 ------------------------------------------82. 細菌 -----------------------

---------------------93. 混合菌株發酵 ------------------------------------104. 兩階段發酵 --------------------------------------10三、生物法降解幾丁質 --------------------------------111. 生物法降解幾丁質 --------------------------------122. 幾丁質衍生物 ------------------------------------123. 生物活性及應用 -------------------------------

---13參、實驗設計 ---------------------------------------16肆、實驗材料與方法 ----------------------------------17一、材料 -------------------------------------------171. 原料 --------------------------------------------172. 化學藥品及培養基 ---------------------------------173. 培養基配製 --------------------------------------183.1

LAMVAB-A 培養基 --------------------------------193.2 Standard methods caseinate agar 培養基 ---------193.3 幾丁質培養液 ------------------------------------203.4 蝦殼廢棄物培養液 --------------------------------203.5 含蝦殼廢棄物粉末之活化菌液培養基配方 --------------21二、儀器設備 ----------------------------------------21三、實驗方法 ----------

------------------------------221. 中南美白對蝦 (白蝦) 菌株之分離 --------------------221.1 幾丁質分解菌 (Chitinolytic bacteria, CB) --------221.2 乳酸菌分離菌株 (Lactic acid bacteria, LAB) ------222.1幾丁質分解菌及蛋白質分解菌之保存與活化 -------------232.2乳酸菌分離菌株之保存與活化 ------------------------233. 分離菌株基本特性 ---------------------------------24

3.1 革蘭氏染色 -------------------------------------243.2 觸酶試驗 ---------------------------------------243.3 氧化酶試驗 -------------------------------------243.4 產酸能力 ---------------------------------------254. 初步篩選降解蝦廢棄物菌株 -------------------------254.1 幾丁質分解菌 -----------------------------------254.2 蛋白質分解菌

(Proteolysis activity, PB) --------254.3 乳酸菌分離菌株 ---------------------------------264.3.1 幾丁質分解能力 -------------------------------264.3.2 蛋白質分解能力 -------------------------------264.3.1 產酸能力 ------------------------------------265. 降解幾丁質之菌株進一步篩選 -----------------------275.1 幾丁質分解菌 --------------------

---------------275.2 乳酸菌分離菌株 ---------------------------------276. 單一菌株發酵蝦殼廢棄物之篩選 ---------------------276.1 幾丁質分解菌 -----------------------------------276.2 蛋白質分解菌 -----------------------------------276.3 乳酸菌 ----------------------------------------277. 混合菌株發酵蝦殼廢棄物之組合篩選 -----------------287.1 幾丁質分解菌

及蛋白質分解菌 ----------------------287.2 共發酵 (Co-fermentation) ----------------------287.3 兩階段發酵 (Two-step fermentation) -------------287.4 單株及混合菌株發酵產物之總酚、總類胡蘿蔔素及揮發性鹽基態氮含量分析 --------------------------------------------288. 含蝦殼廢棄物粉末之活化菌液培養基 ------------------288.1 幾丁質分解菌 ----------------------------------

-288.2 蛋白質分解菌 -----------------------------------288.3 乳酸菌分離菌株 ---------------------------------299. 乳酸菌接菌時間點探討 -----------------------------2910. 分析方法 ---------------------------------------2910.1 菌數 -----------------------------------------2910.2 pH 值 ----------------------------------------2910.3

還原糖含量 ------------------------------------2910.4 游離胺基態氮含量 ------------------------------3010.5 礦物質含量 -----------------------------------3110.6 可滴定酸 -------------------------------------3110.7 總酚含量 -------------------------------------3210.8 揮發性鹽基態氮含量 ----------------------------3210.9 總類胡蘿蔔素含量 ----

--------------------------3311. 統計分析 --------------------------------------33伍、結果與討論 -------------------------------------34一、中南美白對蝦 (白蝦) 菌株之分離 ------------------341.幾丁質分解菌之篩選 -------------------------------342.蛋白質分解菌之篩選 -------------------------------343.乳酸菌分離株之篩選 -------------------------------35二

、單一菌株發酵蝦殼廢棄物之篩選 --------------------361.以 1% Chitin broth 進行測試 ---------------------361.1 幾丁質分解菌於 Chitin broth 中生長情形 ---------361.2 乳酸菌分離株於 Chitin broth 中生長情形 ---------372. 以 10% SSW broth 測試 -------------------------382.1 幾丁質分解菌及蛋白質分解菌於SSW broth 中生長情形 -382.2 乳酸菌分離株於SSW broth 中生長情形 -------------40三、

混合菌株發酵蝦殼廢棄物之組合篩選 ----------------421.CB 及 PB 共同發酵 10%SSW ------------------------422.CB、PB 及 LAB共同發酵及兩階段發酵 10% SSW --------433.CB、PB 及 LAB單株及混合菌株發酵產物之總酚、總類胡蘿蔔素及揮發性鹽基態氮含量 ------------------------------------44四、發酵條件探討 ----------------------------------451.含有 SSW 活化菌液之培養基配方 --------------------451.1生長

曲線 --------------------------------------451.2.還原糖含量 -----------------------------------472. 乳酸菌接菌時間點探討 ---------------------------47陸、結論 -----------------------------------------49柒、參考文獻 -------------------------------------50捌、圖表 -----------------------------------------64玖、附錄 --------------------

---------------------85圖目錄圖一、幾丁質分解菌 (LV1111、LV1121、LV1157、LV2146、LV2154 及 LV2159)在 1% (w/v) 幾丁質培養液於 37oC 培養七天所得菌數 (A)、pH 值 (B) 及還原糖含量 (C) 變化。-----------------------------------------------------------------------------70圖二、乳酸菌 (LV3201) 在含 1/10 稀釋之 MRSB 之 1% (w/v) 幾丁質培養液及 01/10 稀釋之 MRSB 培養中於 37oC 培養

5 天所得菌數 (A)、pH 值 (B) 及還原糖含量 (C) 變化。------------------------------------------------------------------------71圖三、乳酸菌 (LV3204) 在含 1/10 稀釋之 MRSB 之 1% (w/v) 幾丁質培養液及 01/10 稀釋之 MRSB 培養中於 37oC 培養 5 天所得菌數 (A)、pH 值 (B) 及還原糖含量 (C) 變化。------------------------------------------------------------------------72圖四

、乳酸菌 (LV3212) 在含 1/10 稀釋之 MRSB 之 1% (w/v) 幾丁質培養液及 01/10 稀釋之 MRSB 培養中於 37oC 培養 5 天所得菌數 (A)、pH 值 (B) 及還原糖含量 (C) 變化。------------------------------------------------------------------------73圖五、幾丁質分解菌 (LV1111) 及蛋白質分解菌 (LV1144 及 LV2122) 於 10% (w/v) 蝦殼廢棄物培養液於 37oC 培養七天所得其菌數 (A)、pH 值 (B)、還原糖含量 (C) 及游離胺基態氮含

量 (D) 變化。---------------------------------------------------------74圖六、起始菌數為 8 Log cfu/mL 之乳酸菌 (LV3201、LV3204 及 LV3212) 於含 5 % 葡萄糖之 10% (w/v) 蝦殼廢棄物培養液於 37oC 培養七天所得菌數 (A)、pH 值 (B)、可滴定酸度 (C)、礦物質含量 (D) 及游離胺基態氮含量 (E) 變化。------------------------------------------------------------------------------75圖七、起

始菌數為 7 Log cfu/mL 之乳酸菌乳 (LV3201、LV3204 及 LV3212) 於含 5 % 葡萄糖之 10% (w/v) 蝦殼廢棄物培養液於 37oC 培養七天所得菌數 (A)、pH 值 (B)、可滴定酸度 (C)、礦物質含量 (D) 及游離胺基態氮含量 (E) 變化。------------------------------------------------------------------------------77圖八、幾丁質分解菌 (LV1111) 及蛋白質分解菌 (LV2122) 混合菌株發酵在 10% (w/v) 蝦殼廢棄物培養液於 37oC 培養四天所得

菌數 (A)、pH 值 (B)、還原糖含量 (C) 及游離胺基態氮含量 (D) 之變化。-------------------------------------------------------79圖九、幾丁質分解菌 (LV1111)、蛋白質分解菌 (LV2122) 分別與乳酸菌 (LV3201、LV3204 及 LV3212) 共發酵 (A1、A2 及 A3) 或兩階段發酵 (B1、B2 及 B3) 於 10% (w/v) 蝦殼廢棄物培養液 37oC 培養七天其可滴定酸度 (A)、礦物質含量 (B)、游離胺基態氮含量 (C) 及總酚含量 (D) 之變化。-----------------

----------------------------------------------------------------------------80圖十、LV1111 (A) 及 LV2122 (B) 於營養培養液、1% 幾丁質培養液及 1 % 幾丁質 + 1% 蝦殼廢棄物培養液於 37 oC 培養 48 小時所得之生長曲線。-----------------------------------------------------------------------------------------------------83圖十一、LV1111 (A) 及 LV2122 (B) 於

營養培養液、1% 幾丁質培養液及 1 % 幾丁質 + 1% 蝦殼廢棄物培養液於 37 oC 培養 48 小時所得還原糖含量變化。------------------------------------------------------------------------------------------------84圖十二、乳酸菌分離株 (LV3204) 於不同接菌時間 (第 0、1、2、3 及 4) 接種於幾丁質分解菌 (LV1111) 及 蛋白質分解菌 (LV2122) 混合菌株發酵 10% (w/v) 蝦殼廢棄物培養液於 37oC 培養 3 天所得 LV1111 之菌數 (A)、L

V2122之菌數 (B)、LV3204 之菌數 (C)、pH 值 (D)、礦物質含量 (E) 及游離胺基態氮含量 (F) 之變化。------------------------------------------------------------------85 表目錄表一、由白蝦篩選幾丁質分解菌及蛋白質分解菌之基本特性。-----------------------------------------------------------66表二、由白蝦所得分離株在幾丁質洋菜平板上之透明環大小及在 standard methods caseinate agar 上之白色沉澱大小。-----

-------------------------------------------------------67表三、由白蝦腸道篩選乳酸菌分離株之基本特性。--------------------------------------------------------------------68表四、乳酸菌分離株於幾丁質洋菜平板及 MRSA + CaCO3 培養基上之透明環大小及 standard methods caseinate agar 上之白色沉澱大小。 --------------------------------------------------69表五、蝦

殼廢棄物、蝦殼廢棄物分別由幾丁質 (LV1111)、蛋白質 (LV2122) 分解菌株及乳酸菌分離菌株 (LV3204) 單株及混合發酵產物之總酚、總類胡蘿蔔素及揮發性鹽基態氮含量。----------------------------------------------------------------------82 附錄目錄附錄一、乳酸菌分離菌株基本特性。-------------------------------------------------------------------------------87附錄二、幾丁質、幾丁聚醣及葡萄糖胺標準品於游離胺基態氮分析下其 0.1

N NaOH 之滴定量。----------------------------------------------------------------------------------------88附錄三、乳酸菌 (LV3204) 於 MRS 培養液中 37 oC 培養 48 小時之菌生長曲線。---------------------------------------------------------------------------------------------------89