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國立陽明交通大學 分子醫學與生物工程研究所 蘭宜錚所指導 古庭碩的 開發有效利用乙醯輔酶A之代謝工程設計策略 (2021),提出RO 基因優化關鍵因素是什麼,來自於代謝工程、乙醯輔酶A、丁醛、乙酸丁酯、3-羥基丁酸、合成代謝途徑、設計策略。
而第二篇論文臺北醫學大學 醫學生物科技博士學位學程 張偉嶠所指導 張哲邁的 免疫測序之優化與應用於探討免疫組庫在自體免疫和感染性疾病之特性 (2021),提出因為有 免疫基因定序、免疫基因組庫、生物製劑、類風濕性關節炎、新冠肺炎、T細胞受體的重點而找出了 RO 基因優化的解答。
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開發有效利用乙醯輔酶A之代謝工程設計策略
為了解決RO 基因優化 的問題,作者古庭碩 這樣論述:
乙醯輔酶A (Acetyl-CoA)是所有生物代謝途經中的核心代謝產物,可被用於檸檬酸循環氧化產生能量並提供電子給其他生化反應使用,亦作為包括:脂肪酸、類萜 (Terpenoids)、聚酮 (Polyketide)等合成途徑在內的重要前驅物,利用乙醯輔酶A設計並開發之代謝途徑因而具有廣泛的應用性且可被建立於不同物種中。雖然乙醯輔酶A相關代謝途徑具有很高的發展潛力,然而,若想轉換乙醯輔酶A回到上游代謝物丙酮酸的天然代謝途徑幾乎都需要兩個乙醯輔酶A經脫碳途徑產出一個丙酮酸而減少產率,無碳損途徑如丙酮酸合酶 (Pyruvate synthase) 則具有低活性與厭氧環境之需求,因此,開發一個無碳損
乙醯輔酶A至丙酮酸的代謝途徑具有很大的價值。本研究中基於乙醯輔酶A的衍伸代謝途徑的發展潛力與面對的困難,首先於大腸桿菌中建立以乙醯輔酶為前驅物之丁醛與乙酸丁酯合成途徑,藉由抑制競爭基因、代謝途徑設計、酵素表現量優化、產物移除……等代謝工程策略,達到高產量之生質化學品生產。接著,有鑑於部分物種(如藍綠菌)乙醯輔酶A濃度低難以推動下游代謝物合成,我們建立了一個代謝途徑迴路 (Balanced ATP driving force module) 以提供反應途徑驅動力,並於藍綠菌中證明其能有效提升由乙醯輔酶A合成3-羥基丁酸。最後,本研究建立一經3-羥基丙酸之合成代謝途徑,提供無碳損代謝途徑達成乙醯輔
酶A至丙酮酸之轉換,此途徑可被應用於提升丙酮酸衍生產物產率、二氧化碳再利用等重要代謝工程問題。綜上所述,本論文以乙醯輔酶A的泛用性為基礎,開發多種代謝工程策略以建立高效率乙醯輔酶A轉換平台。
免疫測序之優化與應用於探討免疫組庫在自體免疫和感染性疾病之特性
為了解決RO 基因優化 的問題,作者張哲邁 這樣論述:
T細胞受體組庫(TCR repertoire)之定義為生物體內所有T細胞受體(T-cell receptor, TCR)的集合,由T細胞群中所有T細胞受體的種類與數量所決定。在T細胞發育的過程中,每顆T細胞會經歷T細胞受體基因的V(D)J重組(V(D)J recombination),進而產生不同的T細胞受體基因序列,使得每顆T細胞具有不同的T細胞受體克隆型(clonotype)並產生T細胞的高度多樣性。據估計,這種基因重組機制能產生高達1015種的T細胞受體克隆型,使得T細胞群具有和各式各樣的非自體抗原進行高度專一性結合的能力,T細胞免疫因而得以辨認並消滅外來的病原體和體內的非正常細胞-例
如:被病毒感染的正常細胞或癌細胞。因此T細胞組庫的組成和狀態與免疫系統的活化和功能有著高度的相關。過去由於技術/方法上的侷限,大幅度限制了T細胞受體組庫在分析時能取得的通量和資訊上,因而造成分析大量的T細胞受體成為一件困難的工作。有鑒於這十年間次世代定序(next-generation sequencing, NGS)技術的發展以及在T細胞受體組庫分析上的應用,今日已能透過T細胞受體定序(TCR sequencing, TCR-seq)方法,使得完整並同時解析數百萬個不同T細胞受體的V(D)J序列成為可能。雖然目前市面上已有針對T細胞受體定序的文庫製備平台/方法,但其大部分都有價格昂貴或表現不
佳的缺點。因此本論文之第一部分藉由參考和測試先前文獻在T細胞受體文庫製備(library preparation)所需的寡核苷酸(oligonucleotides)和試劑組,讓T細胞受體定序更為經濟。從本研究的結果中可發現,基於5’端快速擴增互補DNA末端(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技術的修改顯著地增加了T細胞受體文庫製備所需的cDNA模板產量,也大幅度地減少文庫製備所需的花費。這些初步成果顯示測試中的T細胞受體定序平台為T細胞受體定序分析提供了更低的成本以及具可比性的建庫表現。此外,本論文之目標包含建立探討T細胞受體組庫與人類疾病關聯性的分
析流程,因此本論文於第二部分透過T細胞受體定序解析類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)患者於不同生物製劑療程-包含阿達木單抗(adalimumab:腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)抑制劑)、利妥昔單抗(rituximab:CD20抑制劑)和塔西單抗(tocilizumab:白血球介素-6受體(interleukin-6 receptor, IL-6R)抑制劑)治療後的T細胞受體組庫特徵。我們的結果顯示類風濕性關節炎患者達到疾病緩解後,其T細胞受體多樣性、V/J基因使用程度和CDR3長度之分佈在不同生物製劑療程
的治療下沒有差異;然而,我們進一步發現這些類風濕性關節患者在經由生物製劑治療後達到疾病緩解或低疾病活性的情況下,其T細胞受體組庫多樣性的高低和疾病活性的嚴重度呈現負相關。本研究的結果顯示T細胞受體多樣性與疾病活性之間在生物製劑治療後到達疾病穩定期的類風濕性關節患者上具有關聯性。接著,本論文透過T細胞受體定序平台研究感染性疾病患者的T細胞受體組庫特性,因此本論文於第三部分探討新冠肺炎疾病2019(coronavirus disease 2019, COVID-19)患者於急性期為輕度疾病(mild disease)或肺炎(pneumonia)時其恢復期的T細胞受體組庫特徵。我們的結果顯示肺炎患者
相較於輕度疾病患者具有較低的T細胞受體多樣性以及不同的CDR3長度分佈。進一步透過T細胞受體集群(clustering)和註解(annotation)之整合分析,我們發現與嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)相關且為輕度疾病特異的T細胞受體集群具有較高的T細胞受體生成機率、較高的共享性以及較高的CDR3抗原結合區域位點多樣性。本研究結果顯示T細胞受體組庫與SARS-CoV-2相關T細胞受體集群之特性在輕度疾病和肺炎COVID-19患者之間具有差異。最後,本論文呈現如何透過T細胞
受體定序平台探討原發性高血壓(essential hypertension, EH)和醛固酮分泌腺瘤(aldosterone-producing adenoma, APA)誘發之次發性高血壓患者在T細胞受體組庫之間的差異。我們初步的結果顯示醛固酮分泌腺瘤患者相較於原發性高血壓患者具有較低的T細胞受體多樣性;此外我們進一步觀察到T細胞受體生成機率與頻率之間的關聯性強度在醛固酮分泌腺瘤患者有較高的現象。這些發現顯示高血壓患者的T細胞受體組庫狀態會受到醛固酮分泌腺瘤影響。總結來說,本論文之重要性為:以高通量定序技術鑑別T細胞受體組庫與人類疾病之間的關聯性。
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