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中華鱉之解剖、血液相觀察及首次分離到類痘病毒之研究

為了解決X14 包 膜的問題，作者劉邦成 這樣論述：

本論文為世界第一個發現養殖鱉皮膚類痘病毒感染症，本研究的目的是觀察和研究中華鱉之解剖和血液相並建立胚胎初代細胞培養以進行鱉類痘病毒複製及其特性之研究。鱉由尾側靜脈抽血，傷害性最小，較容易抽到血。血液抹片檢查可見紅血球有細胞核，單核球細胞質有空泡，細胞核形為多形性，嗜酸性球核有分葉，異嗜球細胞質呈長條桿狀。雄鱉副睪與腎臟相連，精液經陰莖溝流入雌鱉泄殖腔內。1.5 歲齡成鱉肝臟為黃棕色，隨著年齡增加，黑色素吞噬細胞增多，顏色愈暗沉，7 歲齡成鱉肝臟呈黑色。肝臟分左右兩大葉，腹側面可見右葉比左葉大，肝臟右葉可分為外葉、中葉和內葉，中葉又可分成中外葉和中內葉，左葉可分成分離葉和內葉；7 歲齡

成鱉肝臟葉數跟 1.5 歲齡成鱉相同，但左葉的分離葉會變細長。2 月齡鱉肝臟組織無明顯肝小葉結構，門脈三角區不明顯，少量黑色素吞噬細胞呈散發狀。鱉肺臟無肺泡結構，但有非常多的末端氣體交換單元，有氣管軟骨與蛇相似，肺間質有少量黑色素吞噬細胞。心臟為二心房一心室，有一對大動脈和一對大靜脈，心室和心房間有瓣膜，心室腔中有一軟骨結構之不完全間隔。鱉腎臟為分葉型腎，呈黃棕色或暗紅色，有絲球體和腎小管，無明顯皮質跟髓質區分。組織學檢查雌鱉泄殖腔，有消化道開口、泌尿道開口和輸卵管開口黏膜層，輸卵管黏膜層有形成蛋殼的上皮結構，輸卵管和泄殖腔交界處黏膜層有纖毛，但無形成蛋殼的上皮結構。某一飼養 20,500 隻

50 日齡中華鱉的養殖場，因感染鱉類痘病毒，於一個月內鱉大量死亡，死亡率約 44 ％，導致農民嚴重的經濟損失。臨床症狀可見病鱉厭食、昏睡、頸部腫大，在鱉甲及腿部皮膚有許多水疱及大疱。組織病理學檢查可見典型的急性病變，包括氣球樣變性及表皮角質細胞急性細胞腫脹，在空泡可見小的嗜伊紅性質內包涵體；壞死表皮脫落及真皮層有炎症反應細胞和大量的異噬球浸入，皮膚潰瘍並有深層的炎症反應及細菌二次感染。以 6 隻鱉進行人工接種類痘病毒液，於接種 14 天內實驗鱉陸續死亡，臨床症狀呈現厭食和昏睡，皮膚病灶與養殖場病鱉類似，在頭、鱉甲及腿部皮膚有中至大型水疱，白色環形薄層膿疱及壞死剝落的表皮。鱉胚胎於氣室接種類痘

病毒液，3 天後在絨毛尿囊膜有許多白色的痘斑產生。以穿透式電子顯微鏡檢查養殖場病鱉和實驗接種鱉病變處皮膚，可見大量呈卵圓形、有封套，平均直徑為 239 nm，長度為 483 nm 的病毒顆粒。依型態及大小作比較，此病毒與痘病毒十分相似。為進行鱉類痘病毒複製及特性之研究，因此建立鱉胚胎初代細胞體外培養，至目前為止，在 25 T 細胞培養瓶內，鱉胚胎初代細胞已培養至第 25 代，依型態學判斷，大多為纖維母細胞。細胞培養基之研究結果顯示，L15 培養基最適合鱉胚胎初代細胞培養；RPMI 培養基雖然可用於鱉胚胎初代細胞培養，但細胞生長效果較 L15 培養基差；然而 MEM培養基並不適合鱉胚胎初代細胞培

養。鱉胚胎初代細胞，在 37 °C 的環境下生長速度最快。加入 200 μL 病鱉皮膚類痘病毒乳劑，於 24 孔長滿鱉胚胎初代細胞的培養盤內，在第 2 天可見細胞病變；然而僅加入 20 μL 病鱉皮膚類痘病毒乳劑，在第 5 天才可見細胞病變。以穿透式電子顯微鏡檢查產生細胞病變的初代細胞，可見大量呈卵圓形、有封套的類痘病毒顆粒。類痘病毒毒力顯著的被 5-iodo-2’-deoxyuridine (IUDR)、氯仿和放線菌素D (actinomycin D) 抑制，然而病毒力價則無顯著性被5-bromo-2’-deoxyuridine (BUDR) 抑制；受類痘病毒感染的初代細胞，以acridin

e orange染色結果顯示細胞呈黃綠色。綜合以上結果顯示，鱉類痘病毒為雙股核酸有封套的 DNA病毒。本研究發展鱉胚胎初代細胞培養，已成功地複製鱉類痘病毒，實驗結果可提供學者對養殖鱉類痘病毒感染症有更深刻的了解。