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培養的大白鼠心臟神經節神經元細胞的形態學研究

為了解決belta酵素的問題，作者何宛怡 這樣論述：

本實驗的目的要建立大白鼠心臟神經節神經元的培養模式，觀察由不同天數大的老鼠所培養出的心臟神經元細胞在形狀及大小上是否有所差異。除此外，我們想知道不同的神經在大白鼠心臟神經節的分布情形，而這些神經胜■是否在細胞培養的環境下仍然有所表現，所以我們用 SP、CGRP、NPY 和 VIP 等多株抗體來觀察培養的大白鼠心臟神經節元對於這幾種神經的表現情形，並用心臟神經節的冷凍切片當做 in vivo 的對照，另外並做培養心臟神經節細胞的超顯微結構觀察。 實驗方法細胞培養方面我們取出生後 7-8 (P7)，14 (P14)，20-21 (P21) 及

40 (P40) 天的 Sprague-Dawley (SD) 大白鼠，取下心臟只留心房後壁，剪碎後經過酵素消化，最後將細胞培養在 M199 培養液中。培養期間，用 Nomarski 倒立顯微鏡對培養的細胞做位相差 (phase contrast) 及 differential interference contrast (DIC) 等形態上的觀察。於培養三到六天後，用神經絲 (neurofilaments, NF-L, -M 和 -H) 的單株抗體做免疫細胞化學的染色以鑑別出神經元，另外用不同神經的多株抗體做染色，觀察由不同年齡老鼠培養出的心臟神經節神經元在形態及免疫染色上的差異，並用形

態測量軟體做形態測量上的分析，測量神經元的胞體及細胞核的面積。同時一部分培養的細胞則用樹脂包埋、超薄切片，做穿透式電子顯微鏡的觀察，另一部分的實驗則必須將細胞養在蓋玻片上，做三度空間立體超顯微的觀察。 實驗結果：在神經絲的免疫染色方面，我們發現培養的心臟神經元對 NF-H 及 NF-M 皆有很強的反應，但對 NF-L 則否, 在冷凍切片方面反應結果亦相同。至於反應的部位在培養的心臟神經元方面，NF-H 主要是在胞體和神經突起；而 NF-M 則只有胞體有很強烈的反應，但在冷凍切片染色方面，無論是 NF-H 或是 NF-M 主要反應皆在神經突起上，至於 NF-L 則無論是在 i

n vivo 或是 in vitro 皆沒有反應。 在神經元大小方面，我們發現在離乳期 (21天) 以前，年齡越大的老鼠所培養出的神經元其神經元本體及細胞核越大，但在離乳後，神經元大小沒有明顯的改變。在神經絲的染色之後，心臟神經元可依照其突起的分布，分成三種類型，其中數目最多的為 Type A - 類似單極性神經元，次之的為 Type B - 似多極性神經元，最為罕見的為 Type C - 似雙極性神經元，除此外, Type B 神經元所佔比例有隨年齡增長而增加的趨勢。 在神經的表現方面，我們發現培養的心臟神經節細胞胞體對於 neuropeptide

Y (NPY)、vasoactive intestinal peptide (VIP)、calcitonin gene-related peptide (CGRP) 和 substance P (SP) 皆有或強或弱的反應，但是神經突起只對 NPY 和 VIP 有反應，而且常只有在近端靠近神經本體處的神經突起才有反應。至於冷凍切片方面，神經纖維對於 CGRP、SP、NPY 皆有非常明顯的反應，這些纖維包括心臟神經節神經元周圍的細小纖維，神經節外、大神經束的部分纖維，還有分布在血管壁上的纖維，至於 有 VIP 反應的神經纖維非常稀少。在神經元本體部分，皆有部分的神經元本體對 NPY、VIP、C

GRP 和 SP有反應，對於 SP 有反應的神經元最少；以反應強度而言，神經元胞體對 CGRP 的反應最強，對 SP 的反應最不明顯。另外我們用形態測量的方法測量對 NPY 和 VIP 有反應的神經元大小，發現對 NPY 及 VIP 有反應的神經元比對 NF 有反應的神經元來的小。 超顯微結構方面，培養的大白鼠心臟神經元擁有一般正常神經元的特徵，例如大而淡染的胞體，其內有偏心且略呈橢圓的細胞核及大而明顯的核仁，細胞質中含有大量的線粒體、顆粒性內質網等胞器。而在掃描式電子顯微鏡的觀察下看到神經元表面有非常多的指狀突起。在超顯微的結構觀察中，我們發現培養的心臟神經元之一般形態學

特徵和活體內的神經元相同。 本實驗培養出生後不同時期的心臟神經元，實際測量不同年齡及不同培養天數間神經元大小的變化，並以 NF 細胞化學染色的結果將神經元依形狀分成三類，結果顯示不同年齡的老鼠，其心臟神經元無論在大小或是形狀上皆有差異，因此得知心臟神經節細胞在出生至離乳期間仍在不斷的變化中，另外也發現心臟神經元對於不同的神經胜■反應結果並不相同，將 in vitro 和 in vivo 得到的結果和別人的報告做比較後，我們推測心臟內神經的主要來源為外來的感覺和交感神經的節後神經纖維，而心臟神經元本身也具有分泌某些特殊神經的能力。 本實驗建立一 S

D 大白鼠心臟神經元的培養模式，並證明了培養的心臟神經元的一些形態學特性和活體內的神經元並無明顯差異，此培養模式可提供藥理或生理學的研究者在離體的情況下，直接觀察藥物對心臟神經元的影響。