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東海大學 化學工程與材料工程學系 顧野松所指導 李彥哲的 探討PEDOT修飾之DNA生物感測器製備方法及其性質測試 （2013），提出dj1 8代調整關鍵因素是什麼，來自於電化學生物感測器、聚二氧乙烯噻吩、道諾霉素、甲烯藍、牛血清蛋白、雜交。
探討PEDOT修飾之DNA生物感測器製備方法及其性質測試
為了解決dj1 8代調整 的問題，作者李彥哲 這樣論述：
探討PEDOT修飾之DNA生物感測器製備方法及其性質測試研究生：李彥哲指導教授：顧野松 指導教授簽名：_____________________________________________________________________一、摘要首先探討對氨基苯甲酸(4-ABA)製程之電極，即將PEDOT/Pt電極聚合對氨基苯甲酸使聚二氧乙烯噻吩(PEDOT)表面提供羧酸根，經由交聯劑NHS、EDC的作用使探針DNA能接合於電極，再與互補之目標DNA相互雜交，最後加入電化學指示劑道諾霉素(DNM)，以電化學分析儀感測，實驗後得知聚合4-A
BA影響了電極導電性，另外也確立了掃描電壓0.4 V時的感測目標DNA訊號。另外也測試不同的PEDOT聚合圈數後對PEDOT膜的影響，實驗結果為掃描10圈後再聚合4-ABA，表面無裂縫，進行接合探針及目標DNA後感測具波峰。另外研究中也致力於以不同製備方法之電極達到感測目標DNA的目的，測試以牛血清蛋白(BSA)取代4-ABA，藉由BSA嵌入於PEDOT表面上，再以交聯劑與探針DNA接合，達成最後接合目標DNA的目的，實驗結果以BSA加入濃度1 mg/mL，交聯劑選擇戊二醛為實驗條件選擇，經由優化後將BSA前處理進行加熱及對於交聯時間拉長至12小時增加感測，另外也實驗將交聯劑改為甲烯藍(MB)
，BSA製程之電極改為此指示劑後有較明顯之訊號，另外也將4-ABA製程之電極浸泡MB後進行訊號的確認及比較_____________________________________________________________________二、前言生物感測器即是利用生物元件裝置於感測系統中，最後達到輸出訊號和分析目的，其設計的理念是希望能達到快速、穩定、操作便利、低成本且具高專一、高靈敏度、高選擇性等特性廣泛應用於基因感測、環境檢驗、食品工業、藥品開發等。(Myszka,1999)自從人類開始了基因解讀計畫後，解開基因密碼至今數年的時間，許多研究不斷地致力於尋找不同的技術來檢測生物分子，而
研究也演進擴張至醫療保健體系，至今導向個人醫學的發展，演發出的生物晶片配合基因醫學成了一個相當方便的工具。(Barton,2003)其依功能可分為生物感測器及微處理晶片兩種，感測晶片因其有固定DNA、蛋白質等不同的物質，稱之為探針，不同的探針具有不同的功能，也可發展成微陣列晶片，同時處理多點檢測。微處理晶片則是增強處理待測物的程序及最後分析程序，其應用的技術如毛細管電泳技術和實驗室多功能處理晶片(lab-on-a-chip)等。(林明瑜,2008)電化學DNA生物感測器為一種基因感測技術，提供了高靈敏度、體積小等優點，其原理是利用一電極上固定特定DNA片段(單股DNA)稱之為探針DNA(pro
be)和其互補之DNA進行雜交，由於會有高度的選擇性與互補之DNA相接成DNA修飾電極，並再利用具電化學性質之雜合指示劑如道諾霉素、亞甲基藍等來識別，使最後能達到定性定量的檢測。而藉由這樣的機制發展成DNA生物感測器及DNA芯片，檢測在許多領域的應用如基因診斷、基因分析、快速診斷及醫療應用。DNA固定化為感測器中一重要之步驟常見的方法有三種：吸附法(Byfield,1994)、共價鍵接合法、生物素相互作用，而本研究所使用的方式為共價鍵接合，透過交聯劑使基團以共價鍵的形式連接DNA(Wong,2005)，接合後達到電子傳遞目的。不同的固定化各有其優缺點，共價鍵接合經常被使用，因為共價間接合穩定性
高但其有費時及需一些表面處理的問題。(Mascini,2000),(Rui,2010)本實驗研究中之感測器是在白金電極上聚合導電高分子PEDOT，再於導電高分子上修飾羧酸基，藉由EDC及NHS做為表面活性劑與媒合劑來活化羧酸基，接著將一端修飾氨根的單股DNA探針序列以共價鍵結的方式固定於電極表面。最後以電化學分析儀感測與探針序列雜合之目標序列，並添加電化學雜合指示劑來幫助產生電化學訊號。另外研究中測試不同的製備方法來達成感測的目的進行實驗，將BSA嵌入PEDOT表面提供基團經由交聯劑的作用達成接合探針DNA的目的，藉此取代4-ABA，以此概念，進行不同實驗條件的選擇如BSA加入濃度、交聯劑的選
擇，初步訂定實驗條件後，再進行實驗的優化，希冀此製備電極能具有較佳的感測。最後也將電化學指示劑更改為甲烯藍(MB)，主要測試BSA製程能否具有感測訊號，另外也將4-ABA製程電極浸泡甲烯藍後感測藉以確認訊號，最後也將兩電極的特點加以比較。三、實驗方法與流程首先實驗中經由感測赤血鹽來比較聚合4-ABA對導電性的差異，另外也對於不同聚合圈數所製備的PEDOT/Pt電極，由SEM觀察結構，也將不同PEDOT聚合圈數製備電極，聚合4-ABA後由SEM觀察是否降低裂縫產生。圖一為4-ABA製備電極之流程圖。圖一 4-ABA製備之電極流程圖另外實驗中以BSA取代4-ABA提供基團之電極稱之為BSA製備之
電極，配置不同濃度的BSA，由最終感測決定製程最適濃度，也實驗戊二醛、甲醛為交聯劑之比較，透過BSA加熱前處理及交聯時間不同的優化增加電極之感測，最後實驗浸泡指示劑改為甲烯藍(MB)，將兩種不同電極分別感測，圖二為BSA製程之電極流程圖。圖二 BSA製備之電極流程圖四、實驗結果與討論4.1 4-ABA製程電極導電性差異圖三 聚合4-ABA之赤血鹽感測比較圖由圖三中可知原製備之PEDOT/Pt電極具有較佳之導電性，而當電極經由4-ABA的修飾之後，雖為了接合探針DNA提供了共價鍵所需的基團，但卻也因此降低了電極的導電度。4.2 確認感測訊號由圖四中，電極ds/4-ABA/PEDOT/Pt具
有與其他步驟電極不同的感測波峰，掃描電壓約0.4 V時具有很明顯的波峰，電流約為1.8e-4A，推測具有雜交後的目標雙股DNA之電極，能使道諾霉素嵌入其中，進而放大電化學的感測訊號，故確立了掃描電壓約0.4 V時所產生的波峰。故將此作為研究中後之不同製程比較參考之依據，並且利用4-ABA製程之電極作為文章後續加以比較製程的時間、波峰大小為標的。 圖四 4-ABA製程各步驟之電極感測比較4.3 PEDOT膜之探討由文獻中指出4-ABA製程之電極會有電極裂縫的問題(賴孟村,2007)，為了改善裂縫問題，文獻中已經對於4-ABA聚合電壓有所探討(吳森迪,2011)，故於研究中，將聚合PEDOT掃描
圈數由原本5圈增加為10圈及20圈，經由增加聚合EDOT的掃描圈數，實驗是否能使PEDOT聚合於Pt表面時更加縝密，藉由SEM觀察結構圖。另外將不同掃描圈數的PEDOT/Pt電極再進行聚合4-ABA，經由SEM觀察其結構。圖五 PEDOT/Pt表面結構圖(聚合圈數20圈)圖六 PEDOT/Pt表面結構圖(聚合圈數10圈)將聚合EDOT的圈數改為聚合10圈及20圈後，由圖五可觀察聚合20圈所製備的PEDOT/Pt電極，整體結構呈現許多層層的堆疊所形成不規則結構的皺摺波浪狀，非常的不平整且有許多的裂縫，推測所使用的白金絲規格下，對於聚合PEDOT的圈數若過多，會導致PEDOT的表面崩裂後仍在不
斷地進行聚合，而將聚合圈數改為10圈後，由圖六可觀察出，不規則的堆疊已經消失了，取而代之的是較平整表面上許多顆粒狀，也沒有裂縫的產生。圖七 PEDOT/Pt電極聚合20圈後聚合4-ABA結構圖圖八 PEDOT/Pt電極聚合10圈後聚合4-ABA結構圖由圖七中觀察，聚合圈數調整為20圈後，再行聚合4-ABA，整體的結構依然呈現不規則的結構，表面仍然是崩裂的狀態，無法達到降低裂縫的目的。再由圖八中觀察，聚合圈數10圈，再行聚合4-ABA，綜觀結構可以發現電極表面很多顆粒狀的結構，也有些地方呈現塊狀的呈現，顆粒狀的結構更為明顯，表面無碎裂、碎片的結構，而是依然為顆粒狀的表面結構，無裂縫。 圖九
PEDOT/Pt聚合圈數10圈之感測圖圖九中可看出掃描電壓約0.4 V具有波峰的產生，經由數據處理後，得知掃描10圈之感測電流較5圈多了約0.6e-4A，故由前所知降低了裂縫，增加了感測的導電度，但掃描10圈之波峰高約為掃描五圈的一半，說明了聚合4-ABA的效果降低影響探針DNA的接合，推測可對聚合4-ABA的步驟同時也進行修改。4.4 BSA製程之電極首先實驗製備所需加入之BSA濃度，結果顯示BSA添加量為1mg/mL時，峰高較大。另外對於交聯劑測試了EDC及NHS、甲醛、戊二醛，由實驗結果，EDC及NHS由於實驗交聯官能基之不同，無法達成有效的交聯目的，甲醛及戊二醛的感測波峰峰高雖然相
近，但由於甲醛於本次實驗中的再現性並不佳，故從本次實驗中選擇戊二醛當作之後使用之交聯劑。(Marquie,2001)也對於BSA前處理加熱溫度，由原本的不加熱處理無感測訊號，調整為經加熱處理後，表一中當溫度提高為100℃後整體的峰高跟電流值都有所提昇，推測可能加熱溫度更高使蛋白質解鏈的更完全，因而使較多的氨基裸露於PEDOT的表面，增加了探針DNA的接合，而整體電流值的提升，推測可能因BSA加熱溫度提高，解鏈效果提升，增加了電極表面的電子傳遞，而兩個溫度相比較可知選擇BSA前處理溫度100℃，使得最後得到較佳感測的效果。. 數值BSA加熱溫度 波峰位置(V) 波峰電流(μA) 峰高(μ
A)70℃ 0.381 105.9 2.3100℃ 0.405 124.5 2.7表一 不同BSA前處理加熱溫度感測影響從表二的整理中可知，隨著浸泡時間拉長12hr時，波峰的呈現最佳，故選擇此電極之交聯時間訂為12hr數值交聯時間 波峰位置(V) 波峰電流(μA) 峰高(μA)2hr 0.381 105.9 2.36hr 0.436 119.2 3.412hr 0.423 115.9 4.6表二 改變交聯時間感測比較4.5指示劑改為MB後BSA製程之電極感測此實驗主要是將電化學指示劑改為甲烯藍後，以BSA製程之電極浸泡MB後能否感測出訊號，故實驗一樣以B
SA加入量為1mg/mL、交聯劑為戊二醛、交聯時間12hr等前節實驗所決定的較佳之實驗條件進行實驗，最後浸入MB後，最後進行DPV感測並加以比較感測圖。圖十 電極無盡泡MB之感測圖 圖十一 交聯劑為MB之感測圖圖十為DJ2/DJ1/BSA/PEDOT/Pt電極無浸入MB後進行DPV感測，可發現無浸泡電化學指示劑MB，沒有感測波峰，而圖十一為將BSA製程之電極浸入MB溶液中，再進行DPV感測，從圖中可以發現，與文獻中所知道的MB感測波峰掃描電壓約在-0.25 V(Pinar,2002)(Shana,1997)，此掃描電壓下的確出現明顯波峰，故推測以BSA製程之電極在浸泡MB後，能產生感測波峰
。圖十二 無加入BSA之電極感測結果由圖十二中不加入BSA之製備電極，浸入MB後的感測訊號無法感測出波峰，故推測在不加入BSA的情況下的確影響了電極探針DNA的固定化，無法透過交聯劑與PEDOT表面基團作用形成鍵結，故導致最終無法感測，更加確立此電極的感測效果。 圖十二 4-ABA製程電極浸泡MB感測結果由圖十二中可知，DJ2/DJ1/4-ABA/PEDOT/Pt電極浸泡MB後，掃描電壓約於-0.25 V時也有明顯波峰。由於4-ABA製程之電極為能有效感測目標雙股DNA，所以利用它來測試是否能對於同樣具有電化學指示劑功能的MB產生訊號，由感測結果可知，4-ABA之電極對於浸入MB之後的DP
V感測，能有效的產生訊號，故也因此確立可於BSA製程之電極最後浸入電化學指示劑MB的確能有效的感測目標雙股DNA。五、文獻回顧1. Byfield,M.P.and Abuknesha,R.A. (1994). Biochemical aspects of biosensors. Biosensors&Bioelectronics, 9(373).2. Elicia L.S. Wong, Freya J. Mearns, Justin J. Gooding. (2005). Further development of an electrochemical DNA hybridization
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