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國立中興大學 分子生物學研究所 楊明德所指導 翁嘉翎的 利用代謝途徑改造在大腸桿菌進行 ectoine 之異源生產 （2020），提出k12後保桿關鍵因素是什麼，來自於嗜鹽菌、大腸菌、異源生產。
而第二篇論文國立屏東科技大學 生物科技系 胡紹揚所指導 吳佩珊的 沙福芽孢桿菌對吳郭魚成長促進與免疫調節之研究 （2020），提出因為有 益生菌、沙福芽孢桿菌、吳郭魚、成長促進、免疫調節的重點而找出了 k12後保桿的解答。
利用代謝途徑改造在大腸桿菌進行 ectoine 之異源生產
為了解決k12後保桿 的問題，作者翁嘉翎 這樣論述：
Ectoine (1, 4, 5, 6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidine carboxylic acid) 是一種胺基酸類的小分子，廣泛存在於中度嗜鹽菌中，可以平衡菌體內外部滲透壓，且其抗凍及抗乾燥功能，也可作為蛋白質及酵素的穩定劑及保護劑，因此具有許多應用潛力及商業生產的價值。在我們先前的研究中，已經確認由嗜鹽菌Halomonas magadiensis 選殖之ectA、ectB和ectC基因， 具有在E. coli中進行異源生產 ectoine的能力。本研究旨在利用E. coli代謝途徑的改造，提升ectoine的異源生產。在策略上先藉由選殖與表現在 ec
toine 合成途徑上游的酵素基因，提升合成ectoine的主要原料L-aspartate-β-semialdehyde (AspSA) 的產量；另一方面則減少 AspSA 進入大腸菌胺基酸的生合成途徑。 首先將由H. magadiensis選殖之ectoine生合成基因ectABC，構築到pET24b載體上，完成 pET24b-ectABC表現載體之構築。 然後將過去由E. coli 選殖之aspartate-β-semialdehyde dehydrogenase基因 (asd) 及aspartokinase基因 (lysC)，以卡匣的形式構築至pET24b-ectABC載體上。此外，
為了降低LysC的酵素活性受到lysine負回饋抑制的影響，亦利用定點突變方式，選殖得到可降低 lysine負回饋抑制的lysC突變基因。結果發現，當E.coli 菌株僅帶有pET24b-ectABC表現載體時，以 M9培養經40小時誘導，於胞外培養液中可得到2,337 ± 97 mg/L之ectoine。 當導入lysCT344M突變基因與pET24b-ectABC共表現時，ectoine產量提升1.93倍為4,502 ± 49 mg/L。 若再導入E. coli asd 基因於pET24b-ectAB''C-lysCT344M載體進行共表現，轉殖株胞外 ectoine 產量提升2.14
倍為 5,003 ± 41 mg/L。此外，本研究中也對ectoine 生合成途徑上游的E. coli phosphoenolpyruvate carboxylase基因 (ppc) 進行選殖，並將 ppc基因構築在pMTB1載體上。但是當 ppc基因與ectAB''C、lysCT344M及asd在同一菌體內以相同培養條件進行共表現時， ectoine產量並無太大差異。為了減少AspSA作為E. coli 菌體threonine和methionine生合成的原料，上述經代謝途徑改造之E.coli菌株，也進行thrA基因的剔除，並用於ectoine生產。結果顯示經40小時誘導培養後， 胞外ect
oine 產量可達到8,337 117 mg/L。在提升 ectoine 生產效率上，本研究也嘗試將生產菌株回收重複利用於ectoine生產，同一批生產菌株經進行三次培養後， ectoine累積產量可達 17,127 851 mg/L。綜合上述結果顯示，利用代謝途徑的改變，可以顯著提升ectoine在 E. coli 菌株的異源生產。
沙福芽孢桿菌對吳郭魚成長促進與免疫調節之研究
為了解決k12後保桿 的問題，作者吳佩珊 這樣論述：
疾病問題為吳郭魚養殖永續發展的主要阻礙之一，而利用抗生素治療或預防養殖疾病已衍生抗藥性致病菌與食用安全疑慮等問題，因此發展替代抗生素的疾病控制方式有其必要性。益生菌為水產養殖疾病預防控制之策略之一，本研究由吳郭魚腸道中分離出一株產蛋白酶、纖維素酶、木聚醣酶和澱粉酶之菌株，經由16S rDNA 序列鑑定與生化分析，確認此菌株為沙福芽孢桿菌 (Bacillus safensis)。抗生素敏感試驗結果顯示此菌株對於多種測試之抗生素無抗性。飼料中添加105 CFU/g (G1)、106 CFU/g (G2) 和107 CFU/g (G3) 餵食吳郭魚八週，評估該菌對吳郭魚的成長促進，腸道酵素活性、免
疫調節功能。餵食八週後結果顯示，飼料中添加107 CFU/g沙福芽孢桿菌 (B. safensis) 餵食之吳郭魚，在體重增加與飼料效益上與控制組相較有顯著差異，腸道中之澱粉酶、纖維素酶與脂肪酶也顯著高於控制組。餵食吳郭魚有添加沙福芽孢桿菌 (B. safensis) 之飼料，則頭腎組織中之吞噬活性、呼吸爆與SOD活性及頭腎和脾臟之免疫相關基因 (IL-1、IL-8、TNF-和Lysozyme)分析均顯著高於未添加之控制組，而添加105 CFU/g之組別，血液中溶菌酶活性顯著高於控制組。感染實驗結果顯示沙福芽孢桿菌 (B. safensis) 有助於提升吳郭魚感染魚型鏈球菌 (Str
eptococcus iniae) 之存活率，上述結果證實吳郭魚每日餵食沙福芽孢桿菌 (B. safensis) 有助於成長促進、免疫調節與疾病抵抗，說明篩選之沙福芽孢桿菌 (B. safensis) 具有潛力開發作為水產養殖成長促進與疾病控制之益生菌。