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以卵母細胞分切技術產製之優質複製胚供建立豬胚胎幹細胞株

為了解決khs f20-jj的問題，作者施川立 這樣論述：

本試驗目的為改善複製胚之品質以提高複製豬與建立胚胎幹細胞之效率。試驗一測定抗壞血酸 (ascorbic acid, AA) 與曲古菌素A (Trichostatin A: TSA) 以及兩者共同 (TA) 添加對複製豬胚再程式化與發育之影響。各處理對囊胚率以AA處理組 (50 and 100 μg/mL) 之囊胚率高於對照組 (49.6% and 44.0% vs. 30.7%, P < 0.05)，TSA處理組 (30 and 40 nM) 兩者皆為60%，並顯著高於對照組 (29.4, P < 0.05)，而TA處理組之囊胚率則較AA組高 (58.9% vs. 43.5%, P < 0.

05)。TSA與TA處理之組蛋白 (acH3K9 and K14)乙醯化程度高於AA與對照組。經由TUNEL分析，AA與TA皆可降低囊胚之細胞凋亡率。試驗二則以胚聚合改善複製胚之品質，將兩個(2×)或三個胚(3×)聚合可提高囊胚率 (63.0% 與 73.6%)，而未經胚聚合之對照組僅35.1%。重組囊胚之總細胞數隨聚合之胚數量而不同 (P < 0.05)，最高為3×之126而最低為對照組之55。比較重組囊胚之內細胞團 (inner cell mass) 與總細胞數發現，2× (25.1%) 與3× (26.1%) 之重組胚總細胞數皆顯著高於對照組者(15.3%)。此外，細胞凋亡之比例在2×

(2.7%) 與3× (2.2%) 皆低於對照組 (4.7%)。最後將3×之重組囊胚轉殖入代理孕母後產下七頭仔豬。試驗三之目的在於以重組囊胚建立胚幹細胞株。將2×與3×之重組囊胚培養於飼養層細胞上後，貼盤率、擴增與初級細胞群落皆優於未經胚聚合之對照組 (P < 0.05)。飼養層細胞 (STO與 MEF) 與血清種類 (FBS 與 KSR) 對胚幹細胞之建立並無顯著影響。然而，將胚幹細胞培養於含KSR之培養液，則細胞增殖率下降、外觀異常甚至發生分化或死亡。胚幹細胞培養於α-MEM中(於前第三代)較於DMEM與DMEM/F12中之存活率高 (16.7%, 4.3% 及 6.8%)。此外，初級細胞

群落與第三代後仍存活之細胞量，以TSA處理組 (36.7%與26.7%) 顯著高於對照組(23.1%與11.5%)。綜合上述，添加ascorbic acid與TSA並配合不同處理可改善複製胚之發育潛能。胚聚合可提高複製胚之品質，經由細胞數量的增加、多能性基因表現與降低細胞凋亡基因之表現；將3×重組囊胚轉殖入母體亦可產下仔豬。雖然TSA與胚聚合可顯著改善複製豬胚品質與其胚幹細胞建立，但仍需更進一步的研究。

Sonic Hedgehog對豬卵母細胞體外成熟與胚後續發育之影響

為了解決khs f20-jj的問題，作者阮玉迅 這樣論述：

本研究目的為添加旁泌因子（paracrine）Sonic hedgehog（Shh）以改進體外生產（in vitro production, IVP）之豬卵母細胞與胚之發育能力，並探討Shh訊息傳遞路徑相關分子之表現。試驗一檢測出Shh存在於豬濾泡液（follicular fluid）中，且其含量與濾泡大小有相關。在免疫化學組織染色法，發現在卵母細胞、卵丘細胞與顆粒細胞皆有Shh受體（receptor Patch1, Ptc1）、協同受體Smo（co-receptor Smoothened, Smo）與轉譯因子（transcriptional activator）Gli1之表現，尤其以小濾泡

（直徑小於2 mm）之表現量為最高。相較於對照組，添加Shh（0.5與1 μg/mL）於成熟培養液中有助卵母細胞之成熟（81.9% vs 92.4%與90.4%, p &;lt; 0.05），且成熟後之卵母細胞，其cyclin B1表現量、ERK1/2之磷酸化程度、卵質內鈣離子釋放量（[Ca2+]）、囊胚率與囊胚總細胞數皆較對照組為高。試驗二進一步證實不同胚期之孤雌激活胚（parthenotes）皆含有Ptc1與Smo的mRNA與其蛋白質表現。胚發育於添加Shh（0.5 μg/mL）之培養液，其後續囊胚率與囊胚總細胞數皆最佳。經TUNEL與COMET檢測後，發現在處理組（0.5 μg/mL S

hh）發育之囊胚，細胞之凋亡（apoptosis）率較低。磷酸化之Akt蛋白質表現量在Shh添加處理組發育之囊胚較高（1.22-fold vs 對照組0.66-fold, p &;lt; 0.05），而PARP1/2則較低（0.7-fold, p &;lt; 0.05）。Shh之添加（1 ug/mL）亦有助於體細胞核轉置豬胚體外之發育並降低其apoptosis之百分率。試驗三證實Shh對體外受精豬胚（IVF）之發育亦具有相同效益。觀察組蛋白3（hitone 3）上lysine 9與lysine 14（AcH3K9/K14）之乙醯化（acetylation）程度，發現胚來自添加Shh之成熟培養液

組與胚培養液處理組，其AcH3K9/K14程度以胚來自成熟培養液與胚培養液共同添加Shh之處理組為最高（2-cell stage）。在4-cell胚期時，只有胚來自胚培養液中添加Shh處理組或於成熟與胚發育階段皆添加之處理組維持高程度之AcH3K9/14。另外，Shh之處理對於抗凋亡（anti-apoptotic）基因BcL-xL表現並無明顯之影響，但Bax之表現量則下降。Shh之處理對Oct4與Cdx2之表現亦無影響，而Rex01之表現量則在胚培養液添加Shh處理組之囊胚有增加現象，其中以來自胚培養液添加Shh處理組與共同添加處理組之囊胚其表現量為最高。這些結果顯示Shh在成熟培養液或胚培養

液中有加成作用。綜合以上結果，我們證實Shh訊息傳遞分子（Ptc1、Smo與Gli1）皆表現於豬卵巢組織、卵母細胞與著床前不同胚期之胚。而添加Shh於成熟培養液與胚培養液中可幫助卵母細胞之成熟與後續胚發育，由此結論Shh對豬卵母細胞之體外成熟與胚發育具有助益。然而除了Shh之訊息傳遞，Shh對於豬胚進一步發育之改善仍需要更多的研究。