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阿魏酸酯酶之生產，純化及定性

為了解決nb代儲ptt的問題，作者范陽 這樣論述：

作用於植物細胞壁聚合物之feruloyl esterase為裂解植物細胞壁之重要酵素。此酵素代表催化植物細胞壁聚醣與酚酸間酯鍵之合成或切斷之一群水解酵素。這類酵素廣泛分布於植物及微生物中。本博士論文之部分工作為對這種酵素之分類、生產及其物理化學性質作一整理與回顧，特別是著重於此酵素之重要性及與其相關之阿魏酸(ferulic acid)在工業及醫療上之應用。在本研究第一部分實驗方面，先在以麥稈、玉米芯或麥胚芽製作成之粗半纖維素中培養Aspergillus awamori strain IFO4033，再純化並定性所生產之feruloyl esterase。生質量則以乾重法量測。本實驗也決定fe

ruloyl esterase 之最適酸鹼值及溫度並有系統的探討培養時間、碳及氮源等因素對酵素生產之影響。feruloyl esterase 先利用離心分離，再以透析、離子交換層析及微過濾得到均質酵素並以SDS-PAGE 及IEF-PAGE印證。在每一萃取純化步驟中測量酵素之蛋白質含量及活性。不同儲存條件對酵素活性之影響也是此部分實驗工作之一。在本研究第二部分實驗方面，先探討在不同溫度(288, 298, 308, 318, 328, 338, 348, and 358 K) 及不同阿魏酸乙基酯濃度[(2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 and 16) × 10-4 mol.dm-3

of ethyl ferulate in water]下feruloyl esterase (FAE-II)酯化反應之動力學，然後以Lineweaver-Burk double reciprocal plot 求得動力學參數(最大速度Vmax、Michaelis常數Km及二階速率常數V/K)；並求出及討論溫度對此三動力學參數之影響。從van’t Hoff plot、Arrhenius plot及Eyring plot本研也求得並討論與此生化程序有關之熱力學性質如 (活化焓)、 (活化自由能)、 (活化熵)、 (基質結合自由能)及 (過渡態自由能)。在本研究第二部分實驗方面，先探討在25-85

oC 溫度範圍內一經冷凍乾燥自然態之純化Aspergillus awamori feruloyl esterase (FAE-II)酵素及一交聯feruloyl esterase 聚集酵素(CLEAs)之熱穩定性，再探討某些金屬離子及化學品對FAE-II及CLEAs之影響。藉由DSC、TG 及TGA 本研究也探討酵素之熱失活現象。透過FT-IR及SEM對FAE-II及CLEAs之結構分析並嘗試了解交聯是否對FAE-II之粉末結構造成任何影響。在第四部分實驗中探討從Aspergillus awamori所得天然及活化之FAE-II 酵素對甘蔗渣水解活性。天然FAE-II 酵素與鈣離子結合時會有

活化效果，使得Vmax增加兩倍並提高酵素對產物及GdnHCl去自然態(denaturation)之敏感度，對阿魏酸之Km則幾乎無影響。本研究計算FAE-II 酵素與鈣離子結合所產生活化之相關動力學及熱力學參數以了解鈣離子如何作用，並經由UV- circular dichroism光譜探討GdnHCl對FAE-II酵素之影響。此外，在不同溫度及酸鹼值下，本研究也探討經鈣離子活化之FAE-II酵素之密度及溶解度。. 在最後一部分之實驗中，本研究成功的在複製AwfaeA cDNA、並表現於E. coli中並得到且純化重組酵素。所得之重組AwfaeA酵素經結晶，取x-ray晶相數據，以molecula

r replacement可得到1.2 Å之解析度。重組AwfaeA酵素與阿魏酸複合物之分子結構也可決定到1.0 Å之解析度。