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台灣眼鏡蛇毒素新活性及功能性機制之研究
為了解決persil螢光劑 的問題,作者石一㚬 這樣論述:
台灣眼鏡蛇心臟毒素及cobrotoxin 均具有三指狀結構,且基因分析顯示具有共同的演化起源,但藥理活性上卻具有不同作用。心臟毒素具有多樣活性包括細胞毒性及破膜作用活性,但有研究指出心臟毒素具有抑制Serine protease的活性,而台灣眼鏡蛇心臟毒素是否有此作用機制仍未知;cobrotoxin 則具有突觸後神經毒性,比較胺基酸序列發現 cobrotoxin 和心臟毒素的正負電荷胺基酸分布有明顯差異,電荷差異是否導致生物活性不同仍有待研究。另一方面眼鏡蛇心臟毒素為台灣眼鏡蛇毒高含量的蛋白質,因此研擬以心臟毒素作為偵測台灣眼鏡蛇蛇毒的標的,有鑒核酸適體 (Aptamer) 或分子信標 (M
olecular beacon) 過去的研究可用於偵測蛋白質,因此本論文中分別探討以 Poly (A) 的分子信標及 coralyne 組合偵測平台進行偵測台灣眼鏡蛇心臟毒素,進一步以 Poly (A) 的分子信標及適體結合心臟毒素應用於偵測 Heparin;此外研究心臟毒素抑制胰蛋白酶活性的作用及探討阻斷負電荷胺基酸是否使 cobrotoxin 具有心臟毒素的活性。使用5’-端及 3’-端分別標定螢光基團 FAM 及焠滅劑 DABCYL 的 Poly (A) 分子信標結合 coralyne 關閉分子信標 FAM 螢光信號,因心臟毒素與 Poly (A) 競爭結合 coralyne 致使 FA
M 螢光信號恢復,另外心臟毒素亦可單獨誘導分子信標螢光的焠滅,因此心臟毒素誘使 FAM 螢光信號的變化形成鐘形曲線,而蛇毒神經毒素包括 cobrotoxin 則無此作用,顯示此偵測系統可特異性偵測心臟毒素。過去研究指出心臟毒素可與 Heparin 結合,因此建構 Poly (A)-心臟毒素及核酸適體(aptamer)-心臟毒素組合平台作為檢測 Heparin 的螢光測定法。心臟毒素結合 Poly (A) 分子信標和核酸適體致使 FAM 螢光信號焠滅,而結合 Heparin 導致心臟毒素脫離致使 FAM 螢光信號恢復,因此在緩衝劑及血漿中,此螢光測定法均可高靈敏度和選擇性檢測 Heparin。先
前研究報導心臟毒素可影響 Serine protease 家族蛋白的酵素活性,因此分析台灣眼鏡蛇心臟毒素與胰凝乳蛋白酶的作用,實驗發現台灣眼鏡蛇心臟異構毒素增加胰凝乳蛋白酶活性的能力不同,而結合心臟毒素改變胰凝乳蛋白酶的構象,但心臟毒素並非結合於胰凝乳蛋白酶活性位點的疏水區域,這些結果表明心臟毒素可能透過結合活性部位以外的區域來增強胰凝乳蛋白酶的活性。為釐清負電荷胺基酸是否限制 cobrotoxin 展現心臟毒素的活性,使用 semicarbazide 修飾 cobrotoxin 的羧基,semicarbazide 修飾的 cobrotoxin 除構象特質與心臟毒素相似外,並展現破膜活性,顯示
阻斷負電荷胺基酸可改變 cobrotoxin 的結構及活性作用性質。綜合實驗結果,在本論文證實分子信標可用於偵測心臟毒素,並利用分子信標-心臟毒素及核酸適體-心臟毒素建構 Heparin 的偵測感測器,釐清台灣眼鏡蛇心臟毒素增強胰凝乳蛋白酶活性機制,同時證實阻斷帶負電荷的胺基酸可賦予 cobrotoxin 具有心臟毒素的活性,這些實驗成果驗證台灣眼鏡蛇毒蛋白的新活性機制及其應用性。
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