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魚類乳酸球菌之分子流行病學、快速診斷及其疫苗效力之研究

為了解決sb300通病的問題，作者蔡明安 這樣論述：

乳酸球菌（Lactococcus garvieae）是造成世界上多種淡海水魚類乳酸球菌症的重要革蘭氏陽性菌病原，亦是一種在人類與動物間感染病例逐年增加的人畜共通病原。在台灣，本病症常見於夏季，主要感染包括烏魚及淡水長臂大蝦，然而近年來豆仔魚、吳郭魚、石斑魚、日本鰻、赤目豆、黃鰭鯛及牛蛙等養殖水生動物亦發現有感染跡象，因此本研究收集自1999到2006年間台灣76株乳酸球菌菌株、3株日本青魽鰺乳酸球菌菌株及牛源標準株進行其分子流行病學相關性研究，利用限制酶Apa I 與 Sma I切割不同水生動物來源之乳酸球菌染色體DNA後以脈衝式膠體電泳分析（pulsed field gel electro

phoresis，PFGE），共獲得10種基因型。而台灣養殖魚類所流行之L. garvieae主要以A1/S1基因型為主（佔96.9％），且具有高度同源性。在毒力試驗結果則以A1/S1及A11a/S11基因型L. garvieae對烏魚及吳郭魚具有較高的致病性。此外亦以乳酸球菌alpha/beta fold family hydrolase 基因設計引子發展恆溫圈環型擴增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）用於魚類乳酸球菌之檢測，反應溫度及時間所測得之最佳條件分別為60℃與60分鐘，且反應後之產物可利用SYBR Green I直接肉眼判讀

。另外本研究設計LAMP引子對於檢測菌落數的靈敏度可高於聚合酶鏈鎖反應100倍，僅300菌落數即可被檢出，在感染魚隻樣本檢測亦優於聚合酶鏈鎖反應。由此結果證明本次建立之LAMP應用在魚類乳酸球菌的檢測是一具特異性、快速、簡易及有效的方法。魚類乳酸球菌在台灣尚未有疫苗成功研發之際，本研究利用大腸桿菌表現系統進行乳酸球菌之3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）之選殖並表現出44 kDa的重組GAPDH蛋白，進而分析乳酸球菌之GAPDH其核酸及胺基酸序列發現其他乳酸球菌與相關鏈球菌的相似度高達80.4-100％。另以吳郭魚

為測試魚種，分別以乳酸球菌福馬林不活化全菌菌苗、重組GAPDH蛋白（50μg）與兩者組合疫苗進行免疫，對照組則注射生理食鹽水，在免疫後第四週可見單獨全菌菌苗、重組GAPDH蛋白（50μg）與兩者組合疫苗的特異性抗體力價皆有明顯升高，且乳酸球菌全菌與重組GAPDH組合疫苗組之相對存活率達100％，其次分別為全菌菌苗（87.5％）與重組GAPDH蛋白（50％），足見乳酸球菌之重組GAPDH蛋白確實有加乘死菌疫苗之功效。