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建立芝麻去飽和脂肪酶12轉基因斑馬魚促進亞麻油酸生產

為了解決光陽many 110價格的問題，作者曾郁雯 這樣論述：

α-次亞麻油酸 (ALA, 18:3 n-3) 是必需脂肪酸，屬於Omega 3多不飽和脂肪酸之一（n-3 PUFAs），具有良好的營養價值，但人類和多數脊椎動物無法自行合成α-次亞麻油酸，因此需透過攝取植物的方式取得。分析植物合成ALA的機制，係利用Δ12-去飽和酶（FAD2）將油酸 (OA, 18:1) 轉換為亞麻油酸 (LA, 18:2 n-6)，再藉由Δ15-去飽和酶（FAD3）生成ALA；前期實驗室學長已建立FAD3 轉基因斑馬魚，因此本研究嘗試建立Δ12轉基因斑馬魚，未來可結合Δ15轉基因魚，作為嘗試突破動物無法合成α-次亞麻油酸屏障的研究模型。首先利用合成密碼子優化後芝麻Δ12

去飽和酶基因序列，結合在Tol2載體中，並利用腸道專一性啟動子LFABP搭配Tet-off基因調控系統，以受精卵顯微注射技術建立轉基因魚，可同時表現Δ12去飽和酶基因及紅螢光基因。經注射536個胚胎，存活數350顆胚胎，活存率為65.30%；利用螢光顯微鏡觀察可見經顯微注射8天與三週後，紅螢光皆表現於腸道，成功轉基因魚156隻，轉殖率44.57%。以基因體DNA PCR分析，證實Δ12基因有嵌入斑馬魚染色體中，以real-time PCR分析其Δ12 F0世代斑馬魚copy number分別為約41、9以及11。利用RT-PCR分析顯示F0斑馬魚出現專一性片段，證實 Δ12基因具有轉錄的表現。

利用 Western Blot分析，於約44kDa片段大小位置隱約出現Δ12蛋白質的條帶，但雜訊仍多，尚待後續明確證實。並利用GC-mass儀器分析脂肪酸，於數據顯示Δ12 F0轉基因斑馬魚腸道組織中，LA脂肪酸含量比野生型斑馬魚高達2.7倍，而在肌肉組織當中，數據結果不如預期。後續將Δ12 F0斑馬魚公 : 母 (3:2)進行配缸，總共孵化2572顆胚胎，孵化成仔魚有2475隻仔魚，孵化率為96.23%，利用螢光顯微鏡進行紅螢光篩選，篩選出97隻帶有紅螢光斑馬魚仔魚，計算紅螢光陽性率為3.92%。以基因體DNA PCR分析，證實Δ12基因有嵌入斑馬魚染色體中，且可遺傳至F1斑馬魚體內。再以r

eal-time PCR分析其Δ12 F1世代斑馬魚copy number分別約為58與272；利用RT-PCR分析顯示F1斑馬魚出現專一性片段，證實 Δ12基因具有轉錄的表現。利用 Western Blot分析，於約44kDa片段大小位置隱約出現Δ12蛋白質的條帶，但雜訊仍多，尚待後續明確證實。利用GC-mass分析脂肪酸，數據顯示Δ12 F1轉基因斑馬魚的腸道及肌肉組織內LA含量過低，結果暫不符合預期，仍待後續釐清。