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開發生物感測器平台分析SMN基因點突變、DMD基因缺失型與重覆型及含銅胜肽之研究

為了解決鈦蠍管的問題，作者陳俊安 這樣論述：

近年來各式各樣的生物感測器如雨後春筍般地蓬勃發展，除了帶動生醫材料與分析化學等領域之間的連結，也解決許多原本不易進行之分析。本研究設計數項生物感測器平台，以SMN基因、DMD基因和含銅胜肽等生物分子做為方法開發的模型。 第一部份設計一個”開/關” 蠍型探針生物感測器，檢測SMN1基因中第七號外顯子。此蠍型探針係利用螢光能量共振轉換之方式，藉由螢光機團與猝滅基團達到訊號之傳遞。由PCR反應同時得到SMN1和SMN2之放大片段，而實驗設計僅SMN1基因能由DNA自身雜交(self-hybridization)而得到訊號，實驗中探討生物感測器之設計、PCR條件、雜交條件及毛細管電泳之分析條件

等，本方法成功地分析10個實際臨床檢體，包含3個脊髓肌肉萎縮症(Spinal muscular atrophy，SMA)之患者，和7個不同的含量的SMN1檢體以進行方法之驗證和實驗臨床之應用。本研究提供一個更快速、簡單和靈敏的方法，做為SMA臨床上診斷之工具。 第二部份使用非標示螢光奈米銅團簇針對裘馨氏肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)進行基因檢測，先於PCR引子設計特殊序列，再以PCR放大基因片段，之後加入會產生螢光奈米銅團簇之試劑，如copper ion 和sodium ascorbate，利用雙股DNA與螢光奈米銅團簇之作用而產生螢光。藉

由DMD基因缺失型或重覆型其螢光訊號不同，此法可用於判斷基因型；缺失型會因PCR反應無法做DNA片段之放大，而沒有螢光訊號；重覆型則會因PCR反應能做出比正常型還要多的PCR產物，進一步產生比正常型更強的螢光訊號。本研究針對DMD基因中外顯子第45、46和47進行方法驗證與真實檢體之應用，並分析6位DMD患者之檢體，所得結果與multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)之公定方法對照，發現相符。 第三部份則將雙股DNA換成單股DNA，利用特殊序列之單股DNA與奈米銅可產生螢光而偵測。本法結合PCR、分子倒位探針(Molec

ular inversion probe，MIP)與滾環式擴增法(Rolling circle amplification，RCA)，先以PCR放大其基因片段後，由於MIP與DNA ligase會辨認其SMN1第七號外顯子中(c.840 C>T)之位置，並進行連結反應，因而獲得環型DNA。之後經純化產物之步驟，再利用phi29聚合酶進行滾環式PCR擴增放大，待反應完成後，加入會產生螢光奈米銅團簇之試劑，如copper ion 和sodium ascorbate，所產生之螢光訊號以螢光分光光度計測定。本研究順利應用於80位臨床檢體之SMN1基因檢測，其結果與先前本實驗室所開發之CSCE分析方法皆

為相符。 第四部份利用Cu2+-ABTS-H2O2感測系統之概念，針對含銅胜肽，如藍銅胜鈦及銅胜肽，進行呈色反應之檢測。經探討條件最適化，本方法實際運用於含銅胜肽原料與產品之分析，並應用第三部份之方法來檢測產品中添加銅離子偽造含銅胜肽之情形，含銅胜肽不會與單股DNA反應產生螢光，但銅離子會與單股DNA反應而產生螢光。本研究順利應用於4個真實檢體，並根據實驗設計所得之結果，其中兩個檢體有疑似添加二價銅離子之情形。本研究提供一個快速、簡單、可用肉眼觀察顏色變化的分析方法，以期未來可應用於含銅胜肽之檢測。