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高靜水壓輔助酵素水解藍鯊魚皮發酵物之血管收縮素轉化酶抑制胜肽的純化與鑑定

為了解決2015 CLA250 Sport Pl的問題，作者李孟儒 這樣論述：

藍鯊 (Prionace glauca) 魚皮 (Blue shark skin, BSS)於 100 MPa 下以 Protamex、Alcalase、Protin NY100 及 Protin SD-AY10 水解 24 hr，且水解物抑制血管收縮素轉化酶 (Angiotensin I-converting enzyme, ACE) 之 IC50 值分別為0.064、0.137、0.143 及 0.084 mg/mL，其中以100 MPa處理的 Protamex 水解物 (HHP-Px24) 顯示出最高的 ACE 抑制能力，其 IC50 值為 0.066 mg/mL，且其可溶性蛋白、胜肽

及游離胺基酸的含量分別為677.30、365.89 及 91.63 mg/g。與常壓處理的 Protamex 組別 (NHP-Px24) 相比，HHP-Px24 抑制 ACE 之 IC50 值由 0.086 下降至 0.064 mg/mL。　　接著篩選 Protamex 最適壓力的條件，將 BSS 以 Protamex 分別於 0.1-100 MPa 的條件下水解 24 hr，100 MPa 處理組的 ACE 有效抑制百分比 (Inhibitory Efficiency Ratio, IER) (1004.75%/mg/mL) 較 50 MPa 組 (831.73%/mg/mL) 提高約 12

0%。將 BSS 以 Protamex 於 100、200 及 300 MPa 下水解 10 min，由結果顯示其水解物之 ACE 抑制能力 (IC50 值介於0.618-0.643 mg/mL 之間) 皆無顯著地差異。　　另外，BSS 經乳酸菌(含 Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Bifidobacterium longum) 發酵後 8 小時，其 pH 與乳酸菌菌數分別為 6.1 與 1.8×107 CFU/mL，接著將

BSS 發酵物以 Protamex 於 100 MPa 水解，並於水解 3 hr 之組別 (HHP-FH-Px3) 中具有最高的抑制 ACE 活性之能力 (IC50 為 0.029 mg/mL)，顯示出 HHP-FH-Px3的ACE 抑制效果較 HHP-Px3 (IC50 為 0.204 mg/mL) 約提高 700%。且 HHP-FH-Px3 經模擬腸胃道消化酵素水解後 (HHP-FH-P3-G)，仍保有 ACE 抑制活性 (IC50 = 0.026 mg/mL)，顯示出其水解物對於腸胃道酵素具有抵禦的能力。進一步將 HHP-FH-Px3-G 以膠體層析進行劃分，並劃分出 7 個主要劃分物

(Fraction)，其中以 Fraction E (310-350 Da) 具有最高的 ACE 的有效抑制百分比 (Inhibitory Efficiency Ratio, IER = 7688.62%/mg/mL)。收集 Fraction E 並經由逆向高效液相層析純化分離出五個波峰 E1 至 E5，各波峰之 ACE 的 IER分別為564.3、1087.8、900.3、1602.0 及 14946.6%/mg/mL，並經 ESI/MS/MS 鑑定具有 ACE 抑制能力的胜肽，並於波峰 E4 與 E5 鑑定出胜肽，分別為 Gly-Pro-Lys (GPK) (IC50 = 0.065 m

g/mL) 與 Ser-Gly-Arg (SGR) (IC50 = 0.004 mg/mL)。　　在分子對接方面，胜肽 GPK 抑制 ACE 的能力可能是藉由胜肽 C 端的 Lys 殘基與 ACE 的 S1 活性區域有相互作用。而胜肽 SGR 抑制ACE的效果可能是因為胜肽會與 ACE 的 S1、S2 及 Zn2+ 活性區域形成作用。藍鯊 (Prionace glauca) 魚皮 (Blue shark skin, BSS)於 100 MPa 下以 Protamex、Alcalase、Protin NY100 及 Protin SD-AY10 水解 24 hr，且水解物抑制血管收縮素轉化酶 (

Angiotensin I-converting enzyme, ACE) 之 IC50 值分別為0.064、0.137、0.143 及 0.084 mg/mL，其中以100 MPa處理的 Protamex 水解物 (HHP-Px24) 顯示出最高的 ACE 抑制能力，其 IC50 值為 0.066 mg/mL，且其可溶性蛋白、胜肽及游離胺基酸的含量分別為677.30、365.89 及 91.63 mg/g。與常壓處理的 Protamex 組別 (NHP-Px24) 相比，HHP-Px24 抑制 ACE 之 IC50 值由 0.086 下降至 0.064 mg/mL。　　接著篩選 Protam

ex 最適壓力的條件，將 BSS 以 Protamex 分別於 0.1-100 MPa 的條件下水解 24 hr，100 MPa 處理組的 ACE 有效抑制百分比 (Inhibitory Efficiency Ratio, IER) (1004.75%/mg/mL) 較 50 MPa 組 (831.73%/mg/mL) 提高約 120%。將 BSS 以 Protamex 於 100、200 及 300 MPa 下水解 10 min，由結果顯示其水解物之 ACE 抑制能力 (IC50 值介於0.618-0.643 mg/mL 之間) 皆無顯著地差異。　　另外，BSS 經乳酸菌(含 Lactoba

cillus casei, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Bifidobacterium longum) 發酵後 8 小時，其 pH 與乳酸菌菌數分別為 6.1 與 1.8×107 CFU/mL，接著將 BSS 發酵物以 Protamex 於 100 MPa 水解，並於水解 3 hr 之組別 (HHP-FH-Px3) 中具有最高的抑制 ACE 活性之能力 (IC50 為 0.029 mg/mL)，顯示出 HHP-FH-Px3的ACE 抑制效果較 HHP-Px3 (

IC50 為 0.204 mg/mL) 約提高 700%。且 HHP-FH-Px3 經模擬腸胃道消化酵素水解後 (HHP-FH-P3-G)，仍保有 ACE 抑制活性 (IC50 = 0.026 mg/mL)，顯示出其水解物對於腸胃道酵素具有抵禦的能力。進一步將 HHP-FH-Px3-G 以膠體層析進行劃分，並劃分出 7 個主要劃分物 (Fraction)，其中以 Fraction E (310-350 Da) 具有最高的 ACE 的有效抑制百分比 (Inhibitory Efficiency Ratio, IER = 7688.62%/mg/mL)。收集 Fraction E 並經由逆向高效液

相層析純化分離出五個波峰 E1 至 E5，各波峰之 ACE 的 IER分別為564.3、1087.8、900.3、1602.0 及 14946.6%/mg/mL，並經 ESI/MS/MS 鑑定具有 ACE 抑制能力的胜肽，並於波峰 E4 與 E5 鑑定出胜肽，分別為 Gly-Pro-Lys (GPK) (IC50 = 0.065 mg/mL) 與 Ser-Gly-Arg (SGR) (IC50 = 0.004 mg/mL)。　　在分子對接方面，胜肽 GPK 抑制 ACE 的能力可能是藉由胜肽 C 端的 Lys 殘基與 ACE 的 S1 活性區域有相互作用。而胜肽 SGR 抑制ACE的效果可能是

因為胜肽會與 ACE 的 S1、S2 及 Zn2+ 活性區域形成作用。