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國立臺灣大學 藥理學研究所 蕭水銀所指導 劉煥渟的 有機汞與三氧化二砷抑癌作用之研究 (2003),提出SHOEI IG關鍵因素是什麼,來自於黑色素瘤、三氧化二砷。
而第二篇論文國立臺灣大學 毒理學研究所 蕭水銀所指導 王柏森的 一氧化氮及轉譯因子活化導致巨噬細胞凋亡之訊息傳遞之研究 (1999),提出因為有 一氧化氮、脂質多醣體、活性氧的重點而找出了 SHOEI IG的解答。
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有機汞與三氧化二砷抑癌作用之研究
為了解決SHOEI IG 的問題,作者劉煥渟 這樣論述:
黑色素細胞瘤是常見的致死皮膚腫瘤之一,因為具有很強的轉移能力又容易產生化療的抗藥性,尋找新的藥物是刻不容緩。在本論文中,我們研究三種藥物(三氧化二砷, As2O3;thimerosal, TMHg;phenylmercuric acetate, PHgAc)對黑色素瘤細胞毒性及其作用機轉,這三種藥物在這方面的研究尚未有人報告,我們是最先發現它們具有抑制黑色素細胞瘤的有效性,我們規劃比較它們對鼷鼠黑色素細胞瘤(B16F10)的毒殺效果,可能經過的訊息傳遞路徑和抑制瘤細胞體內生長及轉移作用As2O3 結合TMHg或PHgAc的合併作用,顯示對B16F10黑色素瘤細胞毒殺作用的加強效果。TG也增強
TMHg和PHgAc對B16F10黑色素瘤細胞毒殺作用,但會減少As2O3的作用。TMHg, PHgAc 和As2O3 導致細胞週期停留在G2/M階段,並且減少G0/G1階段的比例,因三者均可增加Sub-G1階段的比例,顯示其毒殺作用可能經由細胞凋亡的過程。藉由型態改變、彗星分析、Hoechst 33258染色分析,發現三種藥物在高濃度作用下,使B16F10黑色素瘤細胞產生外觀變形、細胞核受到傷害,導致DNA受損,可由彗星分析觀察到彗星托尾程度的不同,分析其傷害程度,最後在Hoechst 33258染色分析下,三者在均會導致細胞凋亡體的出現,證明此三種藥物的毒殺作用皆經由細胞凋亡的路徑。因為細
胞凋亡具有兩種路徑:內在(粒腺體路徑)和外在(死亡受體路徑),由先前的報告指出,As2O3 主要是經由內在路徑來導致細胞凋亡過程,所以我們進而探討三種藥物導致細胞凋亡的訊息傳遞路徑。首先藉由測試細胞體內ROS的含量,在不同時間下(3h, 6h, 8h),三種藥物以不同濃度處理下,B16F10黑色素瘤細胞皆會產生高量的ROS,TMHg和PHgAc在3h和6h可以觀察到ROS急速上升,不過在8h處理下,ROS的產量變低;As2O3 作用比前兩者來的緩慢,在6h和8h處理下,才發現ROS升高,且8h的ROS產量最高,再來測試粒腺體膜電位(ΔΨm)的改變,分別以不同濃度的三種藥物8h處理下,發現TMH
g和PHgAc在不同濃度作用下,B16F10黑色素瘤細胞的ΔΨm皆會升高,只有在20-30μM As2O3 才觀察到ΔΨm減少,說明三種藥物導致粒腺體不同程度的傷害。綜合上述結果,這三種藥物產生ROS使粒腺體損傷,進而釋放前細胞凋亡物質(cytochrome c, AIF, and Smac/DIABLO),形成細胞凋亡體,活化caspase,走向細胞凋亡的路徑。FAS 在很多種人類癌細胞上有選擇性的大量表現因此可以用來當做腫瘤生長指標。本篇論文中,在細胞和動物實驗上,我們藉由西方墨點法來測量B16F10黑色素瘤細胞中FAS活性和癌細胞生長的關係。在細胞實驗結果顯示,處理TMHg, PHgAc
或As2O3 後,B16F10黑色素瘤細胞的FAS蛋白質含量比未經處理的細胞表現量有意義的降低。在動物實驗結果也顯示相似的結果,以B16F10黑色素瘤細胞接種在C57Bl6鼷鼠為模式,接種後連續五天腹腔注射TMHg, PHgAc或As2O3,在第十四天犧牲,解剖取下的腫瘤,比較其重量和大小,顯示了TMHg, PHgAc或As2O3 皆會抑制腫瘤生長,尤其以TMHg, PHgAc具顯著的抑制作用。以取下的腫瘤組織,研磨成萃取液分析。FAS蛋白質含量比注射食鹽水動物的B16F10黑色素瘤細胞中FAS蛋白質表現有意義的降低,其中以注射As2O3動物的腫瘤中FAS蛋白質表現量被抑制的最多。在Balbc
鼷鼠實驗中,TMHg和PHgAc顯示極大抑制腫瘤細胞轉移到肺臟能力。綜合這些結果顯示,這三種藥物 (TMHg、PHgAc、As2O3)可能具有潛力,或野i發展為治療惡性黑色素瘤的藥物。
一氧化氮及轉譯因子活化導致巨噬細胞凋亡之訊息傳遞之研究
為了解決SHOEI IG 的問題,作者王柏森 這樣論述:
一氧化氮(nitric oxide, NO)在我們身體各組織器官內,扮演著一種重要的訊息傳遞者,它具有調節許多不同生理之功能,在巨噬細胞中,NO乃由一氧化氮合成酵素(nitric oxide synthase, NOS)所合成,此NOS可受到細胞分泌的細胞間激素(cytokines)誘發,而外來的已知誘發物尚不多,其中以脂質多醣體(lipopolysaccharide, LPS)對巨噬細胞誘發一氧化氮合成酵素的效價最高,公認為產生一氧化氮的重要來源。而當細胞受到外來刺激時,轉譯因子(transcription factor)的活化對細胞核基因的表現及細胞功能的調節則扮演著重要角色。 我們實驗
室曾研究一種劇毒2,2’,2”-tripyridine(TP),它是除草劑巴拉刈(paraquat)生產過程的副產物,而且已被證實具有致基因突變性,及具有與突觸後乙醯膽鹼受體結合的作用。從化學結構來看,TP乃由三個pyridine在2 position串連而成,每個pyridine環上具有三個不飽和雙鍵,而且均帶有一個具有未成對電子的氮原子。因此TP除了具有金屬離子箝合劑(metal ion chelating agent)的作用外,也可以做為提供自由電子的主體,因此具有相當高的化學活性。當我們嘗試著去闡明TP的致毒機制時,我們想到NO是一刀的兩面,太多時,會導致細胞凋亡,因此試驗TP對巨噬細
胞合成NO的影響,果然TP是一種很強的NOS誘發劑。因此本論文研究的目的在於闡明TP促進巨噬細胞NO產生的作用機制,並研究其對不同轉譯因子(transcription factors)活化及細胞凋亡(apoptosis)之影響。由於TP本身是一種金屬離子箝合劑,因此我們也比較研究其他金屬離子箝合劑對NO產生的影響,以及細胞內各種陽離子變化對此NO合成的訊息傳遞的影響。 酪胺酸活化酵素活性在2,2’,2”-tripyridine誘發巨噬細胞產生一氧化氮的角色 我們發現對小鼠RAW264.7巨噬癌細胞給予處理TP(1-20M)24小時後,可以促進RAW26
4.7巨噬癌細胞產生一氧化氮(NO),而iNOS蛋白及iNOS mRNA的表現量亦增加。若預先處理NOS抑制劑(N-monomethyl-L-arginine 及 aminoguanidine), 蛋白合成抑制劑(cycloheximide) 或RNA合成抑制劑(actinomycin D),皆可以阻斷TP誘發NO產生的作用。我們進一步發現,酪胺酸活化酵素抑制劑(genistein及tyrphostin AG126)可以阻斷TP誘發(1)NO的產生,(2)iNOS蛋白的表現,及(3)轉譯因子nuclear factor kB抑制蛋白(IkB)的降解。因此我們推論TP的作用機轉可能藉由細胞內ty
rosine kinase 傳遞訊息,進而造成轉譯因子nuclear factor kB (NFkB)的活化,及誘導型一氧化氮合成酵素(iNOS)之蛋白質及mRNA表現增加,最後造成NO產生增加。另外,我們也探討TP的金屬離子箝合能力是否參與訊息傳遞作用。 環腺甘單磷酸依賴機轉促進2,2’,2”-Tripyridine在巨噬細胞誘導型一氧化氮合成酵素的表現 在更進一步的實驗中,我們發現TP促進RAW264.7巨噬癌細胞產生一氧化氮的作用,可以被dibutyryl cAMP(cAMP衍生物)所加強。利用不同的phospho-diesterase 抑制劑(3
-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX或RO201724或pentoxifylline),及adenylate cyclase活化劑(forskoline) ,皆可加強TP促進RAW264.7巨噬癌細胞產生一氧化氮及iNOS蛋白表現的作用;相反的,利用不同的adenylate cyclase抑制劑(MDL12330)或protein kinase 抑制劑(staurosporine或H7),以及membrane receptor effector(polymyxin B) 皆可以降低TP促進RAW264.7巨噬癌細胞產生一氧化氮及iNOS蛋白的作用。另外,TP所增加的
細胞內氧化壓力可被staurosporine及polymyxin B所抑制。進一步的,TP可以明顯活化不同轉譯因子(NFkB,ARE及AP-1),若預先處理抗氧化劑或銅離子,則可以阻斷TP的作用。因此,我們推論G protein-adenylate cyclase pathway 及protein kinase C可能參予TP促進RAW264.7巨噬癌細胞產生一氧化氮的作用。 一氧化氮在2,2’,2”-tripyridine誘發巨噬細胞進行細胞凋亡的角色 TP除了具有促進RAW264.7巨噬癌細胞產生一氧化氮的作用外,也可以對RAW264.7巨噬癌細胞產
生細胞凋亡的作用. 我們發現TP造成RAW264.7巨噬癌細胞凋亡的作用,可以被iNOS抑制劑(NMMA,staurosporine,tyrphostin,PDTC)拮抗.而且TP會造成細胞內ATP含量的下降及ERK(extracellular signal regulated kinase)與NFkB的活化.另外,TP亦會降低細胞內銅離子含量,而先給予細胞處理銅離子或pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC),皆可以拮抗TP造成細胞凋亡及銅離子含量下降的作用. 1,10-Phenanthroline (一個潛在的細胞核因子kB 抑制劑) 阻斷巨噬
細胞表現誘發型一氧化氮合成酵素 由於TP具有金屬箝合的作用,為探求在細胞內金屬離子與redox status的關係,我們使用不同的chelating agents來探討其對LPS(lipopolysaccharide)在RAW264.7巨噬癌細胞誘發產生一氧化氮作用的影響.我們發現1,10-phenanthroline (OP)及pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)可以抑制LPS在RAW264.7巨噬癌細胞誘發產生一氧化氮的作用,相反的,bathocuproine-disulfonic acid (BCDS), ethylerediamine
tetraacetic acid (EDTA)及neocuproine (Neo)則無法抑制LPS的作用.我們進一步發現只有PDTC及Neo可以明顯增加RAW264.7巨噬癌細胞內的銅離子含量.另一方面,PDTC及OP則可以抑制LPS促進細胞內reactive oxygen species (ROS)產生的作用.由此可推論,增加細胞內銅離子或許可參予Fenton reaction來促進hydroxyl radical的產生,但是細胞內redox status尚有其他下游因子所調控,進而影響轉譯因子(如NFkB,p53等)的活化與否. 總合以上研究結果,我們推論細胞內銅離子不
但是細胞內調控轉譯因子的樞紐,而且經由此訊息路徑,影響巨噬細胞一氧化氮合成酵素表現,及細胞凋亡的進行.
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