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竹嵌紋病毒複製酵素之RNA戴帽酵素區域之純化與其催化反應步驟之研究

為了解決SUZUKI SFV 650的問題，作者黃亦樂 這樣論述：

中文摘要 竹嵌紋病毒(Bamboo mosaic virus, BaMV)主要感染竹亞科植物，屬於馬鈴薯X病毒群之成員(potexvirus group)，歸類於似a病毒上科(alphavirus-like superfamily)。BaMV之基因體為單股之正意RNA，約6.4-kb，包含5’端cap，5’端非轉譯區(untranslated region, UTR)，5個轉譯架構 (open reading frame, ORF)，3’ UTR與poly(A) tail。BaMV之ORF1可轉譯出一155-kDa之replicase，此蛋白質由N端至C端可區分為capp

ing enzyme domain、helicase-like domain與RNA-dependent RNA polymerase domain (RdRp) domain。BaMV RNA之5’端帽(cap) 結構的形成，是由helicase-like domain所提供之RNA triphosphatase活性與capping enzyme domain之AdoMet-dependent guanylyltransferase活性依照順序反應完成。為了能夠深入解析BaMV capping enzyme之催化機制，在本研究中進行了capping enzyme domain的純化、突變蛋白

質的活性比較，與探討capping enzyme domain對RNA受質專一性的初步實驗。 為了精確分析capping enzyme domain 的活性，所以本論文第一部份的目的為純化由酵母細胞表達之BaMV capping enzyme domain。由於酵母細胞表現的BaMV capping enzyme domain為膜蛋白質，經由不同界面活性劑的測試，發現離子性的sarkosyl (0.6 %) 將此膜蛋白質水溶性化的效果最好。將C端融合了His-tag之capping enzyme domain以sarkosyl水溶性化後，可以由金屬親和性層析純化得到。經由融

合螢光重組蛋白質的觀察，發現capping enzyme位於酵母細胞中之某種胞器。隨即建構capping enzyme domain之N端或C端截斷蛋白，並且融合於EGFP; 藉由螢光分佈觀察capping enzyme domain在酵母細胞中分佈的位置，且配合高速離心之水溶性測試，以鑑定capping enzyme domain與膜依附之區域 (membrane-associated region)。 第二部分在探討capping enzyme domain中重要性胺基酸對本身methyltransferase活性與/或guanylyltransferase活性的影響，

故設計了單點胺基酸突變為alanine之16個突變株，並比較突變後的酵素活性。當單點突變分別在保留性胺基酸 (D122，R125及Y213) 與非保留性之H66，則造成methyltransferase與guanylyltransferase活性的喪失; 當突變發生在保留性胺基酸H68，此突變株具有完整的GTP methyltransferase活性，但guanylyltransferase卻完全喪失; 而其他突變蛋白質的兩種活性呈現相似的減弱之趨勢。藉由UV-cross linking分析每個突變株對AdoMet的結合能力，再和它們的活性趨勢比較，發現活性趨勢與AdoMet的結合能力具有良好

的相關性。H68A是一個特別的突變株，具GTP methyltransferase活性，但喪失guanylyltransferase活性; 進一步分析H68A與AdoMet和GTP作用之後形成的產物，證實為m7GTP。然而，此m7GTP只有在AdoHcy存在之下，才可被轉移至野生株capping enzyme上，而形成共價鍵結之m7GMP-enzyme intermediate，反映出AdoMet/AdoHcy的結合對m7GMP-enzyme intermediate的形成極為重要。 第三部份在探討m7GMP:RNA transguanylation之反應。根據BaMV c

apping enzyme的研究顯示，m7GMP-enzyme intermediate形成後，推測capping enzyme domain將所共價結合之m7GMP轉移至RNA之5’ diphosphate終端，而形成capped RNA; 而在本實驗中發現m7GMP基團可以直接被轉移至GDP，而形成 m7GpppG之cap結構。在未來的工作，將比較m7GMP-enzyme轉移其m7GMP至GDP與至5’ diphosphated-RNA的效率，並進行競爭性試驗，以證實RNA上被BaMV capping enzyme所辨識的部位。