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嗜高溫及嗜鹼性Bacillussp.TS-23α-澱粉酶之特性與突變分析

為了解決cbs 2.0 v.s abs的問題，作者羅蕙芬 這樣論述：

α-澱粉酶為一種可以水解澱粉骨幹α-1，4醣苷鍵之內切型酵素，它被廣泛使用於澱粉轉化糖加工上以生產各種糖漿。嗜鹼及嗜高溫菌Bacillus sp. strain TS-23之α-澱粉酶基因(amy) ，由 1,845個鹼基對組成，可轉譯成分子量大約 69,543 Da之蛋白質，將含有此基因之Escherichia coli菌種培養液，經由硫酸銨劃分沉澱、SephacrylTM S-100及PBETM 94管柱層析等步驟純化，以電泳分析，得一分子量為65 kDa之純化α-澱粉酶(BLA)，此BLA之最適反應溫度及pH值分別為60℃及pH 9.0。對離子金屬及抑制劑穩定性測試中，Mn2+、 Co

2+ 和 Fe2+ 對BLA具有增強效應，而Hg2+ 及 Cu2+ 與蛋白質抑制劑diethylpyrocarbonate 及 N-bromosuccinimide皆對BLA具有強烈的抑制作用。在8% SDS存在下，其依然具有相當的活性，且欲先與6% SDS混合並於30℃靜置一小時，也不會影響其酵素穩定性。在最適反應條件下，以BLA水解soluble starch、amylose、amylopectin 及glycogen，所得水解產物以maltopentose為主。更進一步為方便純化酵素，將amy基因之5’端及3’端各去除96及294個鹼基，並構築到E. coli表現載體pQE-30中，以E

. coli M15為宿主細胞，在IPTG誘導下，T5啟動子啟動表現出 Bacillus sp. strain TS-23 α-澱粉酶N-端帶有六個組織胺酸之融合蛋白質，以SDS-PAGE及活性染色分析，得分子量為56 kDa的蛋白質His6-tagged BLA∆NC，對所純化之酵素進行生化特性分析發現，His6-tagged BLA∆NC之最適操作溫度、pH值及對離子金屬、蛋白質抑制劑穩定性及對基質的特異性，皆與野生型BLA相同。釵h酵素非常容易在氧化系統中失去活性，而蛋白質之甲硫胺酸(methionine)殘基為最易受影響之位置之一，為了增加酵素對過氧化物之抗性， 釵h報告顯示藉由置換該

殘基可以有效改良蛋白質對過氧化氫(H2O2)之抗性， His6-tagged BLA∆NC在蛋白質一級結構上有八個甲硫胺酸殘基(分別在第17、104、208、214、292、315、324及446位置)， 因此利用選位突變方法將甲硫胺酸置換為白胺酸(leucine),以改良其對過氧化氫之抗性。得Met17Leu 、Met104Leu、 Met208Leu、 Met214Leu 、Met292Leu、Met315Leu、 Met324Leu 及Met446Leu八株突變酵素，SDS-PAGE及活性染色分析顯示野生及突變酵素均在大腸桿菌表現一分子量約56 kDa蛋白質，其中Met208Leu即使在

500 mM H2O2 存在下，依然相當穩定，其他突變酵素除了Met214Leu對過氧化氫最敏感外，其餘突變株對過氧化氫之抗性與His6-tagged BLADNC相似。有些報告指出組胺酸(histidine)殘基在澱粉酶與受質結合上扮演重要角色，Bacillus sp. strain TS-23 a-澱粉酶總共包含9個組織胺酸殘基(分別在137、191、239、269、305、323、361、436及475位置)，利用選位突變技術將組胺酸置換為白胺酸，並比較酵素活性及動力學特性，以了解其所扮演角色。經蛋白質表現純化之後，皆可得到分子量為54 kDa的蛋白質，活性染色顯示His137Leu、

His269Leu及 His361Leu無水解活性表現，而His436Leu對熱敏感。His323Leu 和 His436Leu 之比活性比未突變酵素(BLA∆NC)下降52%， His239Leu、 His305Leu及 His475Leu 與BLA∆NC活性相似， 在kcat/Km 的比較中His323Leu 及His436Leu 比BLA∆NC降低 62% ，而His-191、 His-239、 His-305及His-475 之kcat/Km並無明顯差異，由此可知，His-137、 His-269及 His-361為酵素活性之關鍵胺基酸，而His-323及His-436為間接參與酵素催

化弁遄C 經電腦比對發現C-端區域與環糊精醣苷轉移酶之生澱粉吸附區域有很高相似度，因此構築N-端帶有六個組織氨酸及C-端不同程度缺陷之Bacillus sp. strain TS-23 α-型澱粉酶，並將表現之酵素以鎳離子親合性管柱層析純化，SDS-PAGE及活性染色分析，得分子量為65、58、54及49 kDa之缺陷α-型澱粉酶，分別進行生澱粉吸附，實驗結果顯示隨著去除越多C-端胺基酸，α-澱粉�a對生澱粉的吸附能力越低，但是C-端在去除98個以上胺基酸時，並不會造成�-澱粉酶對水解生澱粉的活性及其熱穩定性，經TLC分析其水解生澱粉的主要產物為maltopentose。因此Bacil

lus sp. strain TS-23α-澱粉酶C-端的完整性，與生澱粉吸附有關，但與水解生澱粉活性無關。