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以大腸桿菌表現具有辨識β細胞的單鏈變異區片段之抗體

為了解決硝酸鈉sds的問題，作者吳忠祐 這樣論述：

免疫系統在個體防禦上扮演著主要角色。在外來物入侵後，免疫系統透過辨識、水解、呈獻、活化、增生與分化的過程產生大量得以和外來入侵者作用而使其失去作用的細胞或分子。在免疫學的分析上即為細胞免疫和體液免疫，而體液中的主要作用分子就是抗體。抗體又稱為免疫球蛋白，在單體的結構上為四聚體，包含兩條重鏈和兩條輕鏈由三對雙硫鍵之作用鍵結而成，在構型上形成Y字形，抗體是在其N端為變異區，不同的透過不同胺基酸的排列和組合以達成得以辨識無限的外來物，由於抗體的產生需要有一定的細胞反應和時間，因此在醫療上就有抗體的需求，以於緊急或免疫缺陷的患者使用。以基因工程產生之抗體，因需細胞培養，成本昂貴且製程複雜又耗時，且經

多次使用抗體容易誘發施用者自身的免疫而將外來注入的抗體中和而失效，因此對完整抗體修飾以刪減部分結構而降低抗原性。藉由大腸桿菌的表現以提升表現效率降低成本。所以利用pET29b為表現的骨架，在抗體上保留變異區和單鏈，再用基因工程的技術，於單鏈抗體前加上訊息胜肽，使蛋白質表現後直送至間質區以增加單鏈變異區片段之抗體的可溶性和穩定度，最後利用鈷離子樹酯與重組蛋白質的His結合而將之純化，在SDS-PAGE分析後，可見成功純化單鏈變異區片段之抗體。

蟻巢傘菌漆氧化酶基因在嗜甲醇酵母系統中的表達

為了解決硝酸鈉sds的問題，作者林怡萱 這樣論述：

蟻巢傘菌(Termitomyces)，又稱為雞肉絲菇 ，起源於非洲，分布於亞熱帶地區，屬於擔子菌類中的一屬，是一種白蟻共生真菌，可以產生分解木質纖維素(Lignocellulose)之酵素：漆氧化酶(Laccase)，最早被發現於日本漆樹，主要為分解共生白蟻食物中的木質素，為一種含有銅離子的多酚氧化酶(polyphenol oxidase , PPO)，可以氧化多種有機化合物。它存在於真菌、植物，或一些細菌之中，能夠分解木質素。本實驗利用與黑翅土白蟻共生的蟻巢傘菌之子實體，經實驗室前人基因選殖獲得漆氧化酶 cDNA 序列，再依據嗜甲醇酵母密碼子使用偏好，設計重組漆氧化酶，委託生技公司合成基因

，將重組漆氧化酶pCYL1004與pCYL2878轉型至 DH5α，純化質體與限制酶切割後選殖目標基因進入 pPICZαA 載體中，經培養與篩選後，將質體線性化，轉型到嗜甲醇酵母菌株，以甲醇誘導表現，獲得具有功能性的重組漆氧化酶，實驗結果顯示: 在BMMY培養基培養pPICZ-CYL2878(X-33)，使用0.5 %甲醇誘導、添加0.4 mM硫酸銅培養10天，粗萃取液活性為50.05 ~ 51.77 U/L；純化後活性為406.15 U/L，約增加為7.84 ~ 8.1倍，比活性為6.9227 U/mg；Native-PAGE膠圖在受質ABTS下有活性呈色； SDS-PAGE CBR染色與硝

酸銀染色膠圖結果顯示，蛋白質大小約70 kDa；酵素動力學分析以2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) 為受質，使用分光光度計測量反應得到Vmax = 0.0166 mM/min、Km = 0.9250 mM、 kcat = 19.8 sec-1；使用光學溶氧度計測量反應得到Vmax = 0.0015 mM/min、Km = 28.7659 mM、 kcat = 1.7899 sec-1。